ridm@nrct.go.th   ระบบคลังข้อมูลงานวิจัยไทย   รายการโปรดที่คุณเลือกไว้

การพัฒนาอนุพันธ์ไคโตซานเพื่อนำส่ง siRNA ที่จำเพาะต่อเซลล์ตับ

หน่วยงาน สำนักงานพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติ

รายละเอียด

ชื่อเรื่อง : การพัฒนาอนุพันธ์ไคโตซานเพื่อนำส่ง siRNA ที่จำเพาะต่อเซลล์ตับ
นักวิจัย : ปราณีต โอปณะโสภิต , Praneet Opanasopit
คำค้น : Biochemistry , Biological sciences , Biology and biochemistry , BT-B-01-MG-16-4813 , Chitosan , Liver cells , ตับ , ศูนย์พันธุวิศวกรรมและเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ , สาขาวิศวกรรมศาสตร์และอุตสาหกรรมวิจัย , เซลล์ตับ , ไคโตแซน
หน่วยงาน : สำนักงานพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติ
ผู้ร่วมงาน : -
ปีพิมพ์ : 2550
อ้างอิง : http://www.nstda.or.th/thairesearch/node/2086
ที่มา : -
ความเชี่ยวชาญ : -
ความสัมพันธ์ : -
ขอบเขตของเนื้อหา : -
บทคัดย่อ/คำอธิบาย :

วัตถุประสงค์ของการศึกษาวิจัยนี้เพื่อเตรียมอนุพันธ์ของไคโตแซนจากแหล่งผลิต ในประเทศไทยในรูปเกลือ เพื่อนำมาประยุกต์ใช้เป็นระบบนำส่ง siRNA เข้าเซลล์ตับ ตลอดจนการนำคอมพิวเตอร์มาช่วยวิเคราะห์และประมวลผลของคุณสมบัติของอนุพันธ์ ที่มีผลต่อการประยุกต์ใช้ในการเป็นระบบนำส่ง siRNA ที่ดี ผลการทดลองพบว่าสามารถเตรียมอนุพันธ์ไคโตซานในรูปเกลือชนิดต่างๆ ได้แก่ เกลือไฮโดรคลอไรด์ แลกเทต แอสพาเทต และกลูทาเมต โดยละลายไคโตซานที่มีขนาดน้ำหนักโมเลกุล 20, 45, 200 และ 460 kDa และมี % degree of deacetylation ประมาณ 85 % ในกรด ทำการพ่นแห้งโดยเทคนิค spray drying ได้ % yield ประมาณ 18-52% ทั้งนี้ขึ้นอยู่กับน้ำหนักโมเลกุลของไคโตซาน โดยน้ำหนักโมเลกุลที่สูงขึ้นจะมี % yield ลดลง เกลือไคโตซานมีลักษณะอนุภาคเป็นรูปทรงกลมเกาะกลุ่ม สามารถละลายน้ำได้ดีขึ้นเมื่อเปรียบกับผงไคโตซานที่ไม่ผ่านการละลายในกรดและ การพ่นแห้ง ผลการศึกษาคุณสมบัติทางความร้อนของเกลือไคโตซานทั้ง 4 ชนิดแสดงการสูญเสียน้ำที่อุณหภูมิประมาณ 60 oC และเกิดการสลายตัวที่อุณหภูมิประมาณ 175-240 oC โดยน้ำหนักโมเลกุลไม่มีผลแตกต่างกันมากนัก จากการศึกษาคุณสมบัติการเลี้ยวเบนของรังสีเอ็กซ์และคุณสมบัติทางความร้อน แสดงว่าเกลือไคโตซานทั้ง 4 ชนิดที่เตรียมจากไคโตซานน้ำหนักโมเลกุลต่างๆ อยู่ในรูปอสัณฐาน และผลของ FTIR และ solid-state 13C NMR spectra ยืนยันว่าไคโตซานที่เตรียมนี้อยู่ในรูปเกลือของกรดเหล่านั้น การศึกษาคุณสมบัติทางกายภาพ โดยการวัดขนาดและประจุอนุภาคของคอมเพล็กซ์ ไคโตซานกับ siRNA-GFP ที่อัตราส่วน N/P ratios ต่างๆ คือ 8, 16, 32 และ 64 พบว่า เมื่อ N/P ratio เพิ่มขึ้น อนุภาคของคอมเพล็กซ์จะมีประจุบวกเพิ่มขึ้น เมื่อพอลิเมอร์เพิ่มขึ้น และเมื่อ pH ของคอมเพล็กซ์เป็น 6.2 CS/siRNA คอมเพล็กซ์มีประจุประมาณ +10-+15 mV แต่ถ้า pH ของคอมเพล็กซ์เป็น 7.2 ที่ N/P ratio 8 และ 16 จะมีประจุ เป็น -20 และ -15 mV ตามลำดับและประจุจะเป็นกลางและบวกเล็กน้อย เมื่อ N/P ratio เพื่อขึ้น เป็น 32 และ 64 และเกลือไคโตซานทั้ง 4 ชนิดให้ผลในทำนองเดียวกัน และเมื่อน้ำหนักโมเลกุลของไคโตซานเพิ่มขึ้น พบว่าค่าประจุไม่มีความแตกต่างกัน ส่วนขนาดอนุภาคนั้นพบว่า โดยรวมมีขนาดอยู่ในช่วงนาโนเมตรในทุก N/P ratio การตรวจสอบการเกิดสารประกอบเชิงซ้อนสมบูรณ์โดยวิธี gel retardation assay พบว่า เกลือไคโตซานทั้ง 4 ชนิดสามารถเกิดคอมเพล็กซ์กับ siRNA-GFP ได้ โดยเริ่มเห็นสารประกอบเชิงซ้อนที่ N/P ratio 8 และเกิดสารประกอบเชิงซ้อนเพิ่มขึ้นเมื่อ N/P ratio เพิ่มขึ้น การทดสอบประสิทธิภาพของ polyethyleneimine (PEI) ในการนำส่ง siRNA เข้าสู่เซลล์ (Hela cells) ที่ผลิต GFP อย่างถาวร พบว่าประสิทธิภาพในการยับยั้งการสร้างโปรตีน GFP จะสูงที่ N/P ratio เท่ากับ 16 และ 32 คือประมาณ 60 เปอร์เซนต์ การทดสอบความเป็นพิษพบว่าจะเพิ่มขึ้นเมื่อ N/P ratio เพิ่มขึ้นและ N/P ratio 64 เซลล์จะตายมากจนไม่สามารถเห็นผลการยับยั้ง การทดสอบประสิทธิภาพของ PEI ในการนำส่ง siRNA เข้าสู่เซลล์ตับ (HepG2 cells) ที่ผลิต GFP อย่างถาวร พบว่า ทั้ง PEI และ Gal-PEI ในทุก N/P ratio (4-32) เป็นพิษต่อเซลล์ตับจนไม่สามารถทดสอบประสิทธิภาพในการยับยั้งการสร้างโปรตีน GFP ได้ การทดสอบประสิทธิภาพของ CS ในการนำส่ง siRNA เข้าสู่ Hela cells ที่ผลิต GFP อย่างถาวร พบว่าโดยภาพรวม CS-HCl นำส่ง siRNA ได้ดีที่สุด โดยที่ CS-HCl20 N/P ratio 8 ให้ผลยับยั้งการสร้าง GFP สูงที่สุด ประมาณ 55 % เปอร์เซ็นต์การรอดชีวิตของเซลล์ที่ได้รับคอมเพล็กซ์ของ siRNA กับเกลือไคโตซานแต่ละชนิด ทุกน้ำหนักโมเลกุล และทุก N/P ratio ให้ค่าสูงกว่า 80% การศึกษาเปรียบเทียบผลการนำส่ง siRNA ในเซลล์ตับ (HepG2 cells) ที่ผลิต GFP อย่างถาวร ของ CS-HCl20 กับ Gal-CS-HCl20 ที่มีน้ำตาลกาแลคโตสในปริมาณแตกต่างกัน 4 ระดับ (2, 3, 7 และ 9) พบว่าน้ำตาลกาแลคโตสไม่ได้ช่วยเพิ่มการนำส่งคอมเพล็กซ์เข้าสู่เซลล์ตับ ส่วน CS-Lac20 พบว่า ที่ N/P ratio 4 8 16 และ 32 Gal-CS-Lac 20 ที่มีน้ำตาลทั้ง 3 ระดับ (2, 3 และ 4) ให้ผลใกล้เคียงกัน โดยให้ผลยับยั้งการสร้าง GFP สูงกว่า CS-Lac20 ที่ N/P ratio เดียวกัน เปอร์เซ็นต์การรอดชีวิตของเซลล์ที่ได้รับคอมเพล็กซ์ที่มีหรือที่ไม่มีน้ำตาล ให้ค่าใกล้เคียงกัน โดยให้ค่าเกิน 80 เปอร์เซ็นต์ แบบจำลองอินซิลิโคของประสิทธิภาพของเกลือไคโตซานรูปเกลือในการเป็นสารช่วยนำ ส่ง siRNA เข้าสู่เซลล์ โดยการดูผลการยับยั้งการแสดงออกของยีน GFP ถูกพัฒนาขึ้นโดยใช้วิธี artificial neural network พบว่าการใช้ข้อมูลการยับยั้งการแสดงออกของยีน GFP ณ วันที่ 5 ซึ่งเป็นวันที่มีผลการยับยั้งการแสดงออกของยีน GFP สูงสุด และการใช้น้ำหนักโมเลกุล และ N/P ratio ร่วมกับ topological descriptors เป็นตัวแปรอิสระจะให้แบบจำลอง ANN (configuration 13-4-1) ที่มีความสามารถในการทำนายที่ดีกว่าแบบจำลองที่สร้างโดยวิธี Multiple linear regression (RMSE = 0.261 สำหรับวิธี ANN และค่า RMSE = 1.378 สำหรับวิธี MLR) ยิ่งไปกว่านั้นเมื่อทดลองนำข้อมูลที่ไม่เคยใช้ในการสร้างแบบจำลองมาทดสอบ ความสามารถในการทำนายของแบบจำลองที่สร้างขึ้นด้วยวิธีทั้งสอง พบว่าแบบจำลองที่สร้างโดยใช้วิธี ANN แสดงความสามารถในการทำนายที่ดีกว่าการใช้วิธี MLR โดยให้ค่า standard error of prediction = 0.291 สำหรับวิธี ANN และ 1.597 สำหรับวิธี MLR ดังนั้นงานวิจัยนี้ประสบความสำเร็จในการสร้างแบบจำลองด้วยวิธี ANN โดยมี topological descriptors เป็นพารามิเตอร์ที่จำเป็นร่วมกับพารามิเตอร์ที่เป็นมวลโมเลกุลและ N/P ratio โดยแบบจำลองที่ได้มีความสามารถในการทำนายประสิทธิภาพของไคโตซานรูปเกลือใน การเป็นสารช่วยนำส่ง siRNA เข้าสู่เซลล์ได้

บรรณานุกรม :
ปราณีต โอปณะโสภิต , Praneet Opanasopit . (2550). การพัฒนาอนุพันธ์ไคโตซานเพื่อนำส่ง siRNA ที่จำเพาะต่อเซลล์ตับ.
    ปทุมธานี : สำนักงานพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติ.
ปราณีต โอปณะโสภิต , Praneet Opanasopit . 2550. "การพัฒนาอนุพันธ์ไคโตซานเพื่อนำส่ง siRNA ที่จำเพาะต่อเซลล์ตับ".
    ปทุมธานี : สำนักงานพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติ.
ปราณีต โอปณะโสภิต , Praneet Opanasopit . "การพัฒนาอนุพันธ์ไคโตซานเพื่อนำส่ง siRNA ที่จำเพาะต่อเซลล์ตับ."
    ปทุมธานี : สำนักงานพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติ, 2550. Print.
ปราณีต โอปณะโสภิต , Praneet Opanasopit . การพัฒนาอนุพันธ์ไคโตซานเพื่อนำส่ง siRNA ที่จำเพาะต่อเซลล์ตับ. ปทุมธานี : สำนักงานพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติ; 2550.