ridm@nrct.go.th   ระบบคลังข้อมูลงานวิจัยไทย   รายการโปรดที่คุณเลือกไว้

การพัฒนาวิธีการตรวจวัดอย่างรวดเร็วเพื่อเลือกสายพันธุ์ข้าวโพด ซึ่งต้านทานต่อ Aspergillus

หน่วยงาน สำนักงานพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติ

รายละเอียด

ชื่อเรื่อง : การพัฒนาวิธีการตรวจวัดอย่างรวดเร็วเพื่อเลือกสายพันธุ์ข้าวโพด ซึ่งต้านทานต่อ Aspergillus
นักวิจัย : ไมตรี สุทธจิตต์ , Maitree Suttajit
คำค้น : 35 01 0105 , Aspergillus , Biological sciences , ELISA , Enzyme-Linked Immunosorbent Assay , Plant biotechnology , Plant biotechnology and related agricultural science , ข้าวโพด , พันธุ์ , ศูนย์พันธุวิศวกรรมและเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ , สาขาเกษตรศาสตร์และชีววิทยา , อะฟลาท็อกซิน บี 1 , อีไลซ่า , เชื้อรา , แอสเปอร์จิลัสฟลาวัส
หน่วยงาน : สำนักงานพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติ
ผู้ร่วมงาน : -
ปีพิมพ์ : 2538
อ้างอิง : http://www.nstda.or.th/thairesearch/node/2008
ที่มา : -
ความเชี่ยวชาญ : -
ความสัมพันธ์ : -
ขอบเขตของเนื้อหา : -
บทคัดย่อ/คำอธิบาย :

เนื่องจากผลิตภัณฑ์ทางการเกษตรได้แก่ ถั่วลิสง ข้าวโพด และอาหารสัตว์ มักมีสารพิษอะฟลาทอกซินบีหนึ่ง (AFB1) ซึ่งเป็นสารก่อกลายพันธุ์และสารก่อมะเร็งตับปนเปื้อนอยู่ สารพิษนี้สร้างมาจากเชื้อราพวกแอสเปอร์จิลัสฟลาวัสและพาราซิติกัส หากไม่มีการควบคุมอะฟลาทอกซินจะก่อปัญหาด้านสุขภาพของสัตว์และคน ความรุนแรงของพิษที่ได้รับขึ้นอยู่กับปริมาณของ อะฟลาทอกซินที่คนและสัตว์ได้รับเข้าไป และยังก่อปัญหาทางด้านเศรษฐกิจ ในการส่งสินค้าเกษตรออก จำหน่ายต่างประเทศ อีกด้วย สำหรับการตรวจวัด AFB1 ในธัญพืชและผลิตภัณฑ์ทางอาหารมีหลายวิธี อาจใช้วิธีทางเคมีเช่น โครมาโทรกราฟีผิวบาง (thin layer chromatography, TLC) หรือโครมาโทรกราฟีสมรรถนะภาพสูงโดยใช้คอลัมน์และความดันร่วม (high-performance liquid chromatography) หรือสเปคโตรเมตรีแยกมวลสาร (mass spectrometry) แต่วิธีการ ดังกล่าวไม่สามารถแยกความจำเพาะต่อชนิดของอะฟลาทอกซิน ผลที่ได้อาจขาดความแน่นอนและความไว การวิเคราะห์ต้องทำสารตัวอย่างให้สะอาด บริสุทธิ์เสียก่อนมีขั้นตอนมากทำให้เสียเวลา และค่าใช้จ่ายสูงประกอบกับเครื่องมือในการตรวจสอบล้วนแต่ราคาแพงต้องใช้ บุคลากรที่มีความรู้และทักษะเป็นอย่างดี ดังนั้นเนื่องจาก ปัญหาหลายประการดังกล่าวโครงการวิจัยนี้จึงมีวัตถุประสงค์เพื่อพัฒนาวิธีการ ในทางปฏิบัติอย่างรวดเร็วในการตรวจวัดอะฟลาทอกซินโดยวิธีอีไลซ่า Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) แบบแถบ เนื่องจากวิธีทางอีไลซ่านับเป็นวิธีที่ไว มีความจำเพาะสูงและราคาประหยัด เหมาะสม ที่จะนำมาประยุกต์ใช้ในสถานที่ต่างๆ นอกห้องปฏิบัติการได้สะดวกและ ง่าย และไม่จำเป็นต้องใช้บุคลากรที่มีความรู้และทักษะเป็นอย่างดีก็ได้ โครงการวิจัยนี้จะได้ประเมินถึงคุณภาพความน่าเชื่อถือความไวของวิธีการและ ความจำเพาะ ต่ออะฟลาทอกซินด้วย รายงานนี้จะเสนอผลงานวิจัยในวิธีการพัฒนา การเตรียมสารและน้ำยาเฉพาะต่างๆ โดยการผลิตแอนติบอดีต่ออะฟลาทอกซินบีหนึ่งขึ้นมาใช้เองในกระต่ายและการเพาะ เลี้ยงเซลล์ไฮบริโดมา และนำไปตรวจวัดปริมาณอะฟลาทอกซินบีหนึ่งในเมล็ดข้าวโพดและวัสดุทางการเกษตร ทั้งที่เกิดขึ้นเองทาง ธรรมชาติหรือโดยทางการทดลองได้ทำการวิเคราะห์โดยวิธีอีไลซ่าแบบแข่งขัน ในขั้นตอนแรกของการตรวจวัดคือการสกัดอะฟลาทอกซินในเมล็ดข้าวโพดด้วยเมทธานอล 80% แล้วนำสารสกัดไปใส่ในจานหลุมพลาสติกแบบแถว (microwell-strip) ซึ่งเคลือบด้วยแอนติบอดีชนิดโพลีโคลนัลหรือโมโนโคลนัลต่อ AFB1 และต่อมาเติมสารคอนจูเกตระหว่าง AFB1 กับเอ็นไซม์ (horseradish peroxidase) ตามด้วยสารสับสเตรท (H2O2) และสารทำให้เกิดสี (OPD หรือ TMB) นำจานหลุมพลาสติกไปวัดสีโดยเครื่อง ELISA reader เปรียบเทียบกับ AFB1 มาตรฐาน นำผลการวิเคราะห์ที่ได้โดยวิธี ELISA มาเปรียบเทียบกับวิธี TLC และน้ำยาสำเร็จรูป ELISA ที่ใช้ตรวจสอบ AFB1 จากต่างประเทศ (น้ำยา Afla-20 Cup สหรัฐอเมริกา, ID Block สหรัฐอเมริกาและชนิด Ridascreen เยอรมันนี) ผลการทดลองพบว่าโดยวิธี microwell-strip ELISA น้ำยาที่ผลิตขึ้นมาสามารถวิเคราะห์ AFB1 ในสารตัวอย่างเมล็ดข้าวโพด ตั้งแต่ 1 ถึง 80 พีพีบี (นาโนกรัมต่อกรัมเมล็ดข้าวโพด) อย่างมีความจำเพาะต่อ AFB1 ดีมากใช้เวลาตรวจวัดภายในหนึ่งชั่วโมงก็ทราบผล หากการวิเคราะห์ AFB1 แบบคุณภาพก็สามารถสังเกตได้ด้วยตาเปล่า โดยการเทียบสีหรือจะวัดปริมาณ AFB1 ได้โดยใช้เครื่องอ่านอีไลซ่าค่าต่ำสุดที่วิธีอีไลซ่าวัดได้คือ 1 ppb ในขณะที่วิธีการตรวจวัด แบบ TLC ค่าต่ำสุดที่วัดได้ 10 ppb และยังพบว่าวิธี ELISA นี้สามารถใช้ทดแทนวิธี TLC ได้ดี เพราะว่าผลของการวิเคราะห์ระดับ AFB1 ในตัวอย่างเมล็ดข้าวโพดจำนวนมากโดยวิธี ELISA มีความสัมพันธ์โดยตรงกับผลของการวัดโดยวิธี TLC โดยทางสถิติมีค่าสัมประสิทธิ์ความสัมพันธ์ (r) = 0.88 และจากการเปรียบเทียบโดยวิธีการทดสอบ Chi-square พบว่าผลการวัดโดยน้ำยาอีไลซ่าที่เตรียมขึ้นเองไม่มีความแตกต่างกันกับผลการ วัดด้วยน้ำยาอีไลซ่าต่างประเทศอย่างมีนัยสำคัญ เพื่อความสะดวกและง่ายต่อการนำไปใช้ได้มากขึ้น คณะนักวิจัยได้พัฒนาเบื้องต้นวิธีอีไลซ่าบนแผ่นวัสดุโดยการเคลือบแอนติบอดี ชนิดโพลีโคลนัลหรือโมโนโคลนัลต่อ AFB1 บนวัสดุพลาสติกแบบแถบหวี (comb-strip จากบริษัท Orgenics อิสราเอล) แทนที่จะใช้จานหลุมแบบ microwell strip วิธีอีไลซ่าแบบแข่งขันบนแผ่นพลาสติกแถบหวีนี้สามารถทำให้เกิดจุดสีปรากฏบน แผ่น และมองเห็นด้วยตาเปล่าสามารถเปรียบเทียบปริมาณ AFB1 ได้ตามระดับความเข้มข้นต่างๆ ของ AFB1 ที่เพิ่มขึ้นความเข้มของจุดสีบนแผ่นพลาสติกแถบหวีนี้สามารถทำให้เกิดจุดสี ปรากฏบนแผ่น และมองเห็นด้วยตาเปล่าสามารถเปรียบเทียบปริมาณ AFB1 ได้ตามระดับความเข้มข้นต่างๆ ของ AFB1 ที่เพิ่มขึ้น ความเข้มของจุดสีบนแผ่นแถบหวีจะลดลงตามลำดับ และทำให้สามารถบอกค่ากำหนดมาตรฐานสูงสุด (cut-off limit) ของ AFB1 คือ 20 ppb ในวัสดุตัวอย่างได้ อย่างเป็นที่พอใจและมั่นใจ ปริมาณที่แน่นอนของโมโนโคลนัลแอนติบอดีจะเคลือบติดกับซีกหวี และนำหวีมาแช่ลงในสารละลายผสมระหว่าง AFB1 ที่ถูกสกัดจากสารตัวอย่าง (ตัวอย่างเช่น เมล็ดข้าวโพด) และ AFB1 ที่ผูกติดกับเอ็นไซม์เครื่องหมายด้วยกรรมวิธีทางเคมี (ตัวอย่างเช่น เปอร์ออกซิเดส) ดังนั้น AFB1 ในสารสกัดจากเมล็ดข้าวโพดและ AFB1 ที่ผูกติดกับเอ็นไซม์จะแข่งขันกันจับกับแอนติบอดีบนผิวพลาสติกของซีกหวี ถ้าสารสกัดมีปริมาณ AFB1 น้อย อะฟลาทอกซินที่ผูกติดกับเอ็นไซม์จะจับกับแอนติบอดีบนผิวพลาสติกได้มาก และติดตามปริมาณของเอ็นไซม์ที่ติดบนผิวพลาสติกนี้ได้ โดยใช้สับสเตรทที่สามารถทำปฏิกิริยากับเอ็นไซม์นี้ซึ่งจะให้ผลเปลี่ยนแปลง เป็นสีเกิดขึ้น ในทางตรงกันข้ามถ้าสารสกัดมีปริมาณอะฟลาทอกซินมากอะฟลาทอกซินที่ผูกติดกับ เอ็นไซม์จะจับกับแอนติบอดีบนผิวพบาสติกได้น้อย ซึ่งเมื่อเติมสับสเตรทลงไปจะให้สีที่มีความเข้มน้อยลงหรือจนเกือบไม่มีสี ดังนั้นความเข้มข้นของสีเกิดขึ้นจะผกผันกับปริมาณอะฟลาทอกซินในสารสกัดจาก เมล็ดข้าวโพด เนื่องจากเราสามารถกำหนดปริมาณของแอนติบอดีที่เคลือบกับผิวพลาสติกให้พอ เหมาะที่จะจับกับปริมาณ AFB1 ตามต้องการ จึงทำให้สามารถบอกค่ากำหนดมาตรฐานสูงสุดของ AFB1 คือ 20 ppb ในวัสดุตัวอย่างได้ นั่นคือสารตัวอย่างที่มี AFB1 มากกว่า 20 ppb จะปรากฏเป็นไม่มีสีเกิดขึ้น ขณะที่สารตัวอย่างที่มี AFB1 น้อยกว่าหรือเท่ากับ 20 ppb จะให้สีฟ้าจางและถ้าไม่มี AFB1 เลยจะปรากฏเป็นจุดสีฟ้าเข้มที่สุดบนผิวพลาสติก จากความสำเร็จของการผลิตน้ำยาอีไลซ่าบนแบบแถบหวีดังกล่าว โครงการวิจัยมีเป้าหมายต่อเนื่องที่จะพัฒนาเทคนิคขั้นก้าวหน้าต่อไปคือ การทดลองใช้แผ่นวัสดุที่สามารถเคลือบแอนติบอดีต่อ AFB1 อย่างมี ประสิทธิภาพ การปรับปรุงรูปแบบเก็บน้ำยาอีไลซ่าและแผ่นแถบที่เคลือบด้วยแอนติบอดีไว้ได้ นาน การทำให้เกิดสีชัดเจนทนนาน และการนำไปใช้ในภาคสนามจนเป็นที่ยอมรับได้ของผู้ใช้

บรรณานุกรม :
ไมตรี สุทธจิตต์ , Maitree Suttajit . (2538). การพัฒนาวิธีการตรวจวัดอย่างรวดเร็วเพื่อเลือกสายพันธุ์ข้าวโพด ซึ่งต้านทานต่อ Aspergillus.
    ปทุมธานี : สำนักงานพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติ.
ไมตรี สุทธจิตต์ , Maitree Suttajit . 2538. "การพัฒนาวิธีการตรวจวัดอย่างรวดเร็วเพื่อเลือกสายพันธุ์ข้าวโพด ซึ่งต้านทานต่อ Aspergillus".
    ปทุมธานี : สำนักงานพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติ.
ไมตรี สุทธจิตต์ , Maitree Suttajit . "การพัฒนาวิธีการตรวจวัดอย่างรวดเร็วเพื่อเลือกสายพันธุ์ข้าวโพด ซึ่งต้านทานต่อ Aspergillus."
    ปทุมธานี : สำนักงานพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติ, 2538. Print.
ไมตรี สุทธจิตต์ , Maitree Suttajit . การพัฒนาวิธีการตรวจวัดอย่างรวดเร็วเพื่อเลือกสายพันธุ์ข้าวโพด ซึ่งต้านทานต่อ Aspergillus. ปทุมธานี : สำนักงานพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติ; 2538.