ridm@nrct.go.th   ระบบคลังข้อมูลงานวิจัยไทย   รายการโปรดที่คุณเลือกไว้

การพัฒนาการใช้เชื้อ Bacillus thuringiensis ในการสร้างฝ้ายจำลองพันธุ์ต้านทานต่อหนอนเจาะสมอฝ้าย

หน่วยงาน สำนักงานพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติ

รายละเอียด

ชื่อเรื่อง : การพัฒนาการใช้เชื้อ Bacillus thuringiensis ในการสร้างฝ้ายจำลองพันธุ์ต้านทานต่อหนอนเจาะสมอฝ้าย
นักวิจัย : ทิพย์วดี อรรถธรรม , Tipvadee Attathom
คำค้น : 38 01 0155 , Bacillus thuringiensis , Biological sciences , Cotton , Helicoverpa armigera , Plant biotechnology , Plant biotechnology and related agricultural science , Transgenic plants , ฝ้าย , พืชตัดแต่งพันธุกรรม , ศูนย์พันธุวิศวกรรมและเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ , สาขาเกษตรศาสตร์และชีววิทยา , หนอนเจาะสมอฝ้าย
หน่วยงาน : สำนักงานพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติ
ผู้ร่วมงาน : -
ปีพิมพ์ : 2541
อ้างอิง : http://www.nstda.or.th/thairesearch/node/1873
ที่มา : -
ความเชี่ยวชาญ : -
ความสัมพันธ์ : -
ขอบเขตของเนื้อหา : -
บทคัดย่อ/คำอธิบาย :

การสร้างต้นฝ้ายจำลองพันธุ์ด้วยการถ่ายยีนควบคุมการสร้างโปรตีนสารพิษของ เชื้อแบคทีเรียBacillus thuringiensis (Bt) เข้าไปในต้นฝ้าย เพื่อให้ฝ้ายต้านทานต่อแมลง เป็นแนวทางใหม่ที่จะพัฒนานำมาใช้ในการควบคุมกำจัดหนอนเจาะสมอฝ้ายอเมริกัน Helicoverpa armigera ทดแทนการใช้สารเคมี เชื้อ Bt ได้ถูกเก็บรวบรวมด้วยการแยกและวิเคราะห์เชื้อจากตัวอย่างชนิดต่างๆ เช่น ดิน ผลิตผลทางการเกษตรในโรงเก็บ มูลไหมในโรงเรือนเลี้ยงไหม อาหารสัตว์ ปุ๋ยและน้ำ ที่เก็บในจังหวัดต่างๆ ทั่วประเทศ จากจำนวนตัวอย่างที่เก็บมาทั้งสิ้น 3,681 ตัวอย่าง แยกได้เชื้อ Bt จำนวน 4,202 isolate พบว่าภาคตะวันออกเฉียงเหนือเป็นแหล่งที่พบเชื้อ Bt มากที่สุด เชื้อ Bt ทั้งหมดได้ถูกนำมาผ่านกระบวนการคัดเลือก 2 ขั้นตอน เพื่อให้ได้เชื้อที่มีประสิทธิภาพดีในการกำจัดหนอนเจาะสมอฝ้าย คือ ขั้นตอนที่หนึ่งใช้เชื้อ Bt ทั้ง culture ในการทำ bioassay กับหนอนเจาะสมอฝ้าย หลังจากนั้นคัดเลือกเชื้อ Bt ที่มีประสิทธิภาพดีมาทดสอบในขั้นที่สอง โดยสกัดเอาเฉพาะโปรตีนสารพิษของเชื้อมาใช้ในการทดสอบ ซึ่งพบว่าเชื้อ Bt ที่คัดเลือกมาทดสอบมีค่า LC50 ของโปรตีนสารพิษอยู่ระหว่าง 0.31-525 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร ในการศึกษาเพื่อจำแนกชนิดของยีนที่ควบคุมการสร้างโปรตีนสารพิษ (cry gene) ด้วยเทคนิค Polymerase Chain Reaction (PCR) ได้คัดเลือกเชื้อ Bt ที่ได้ผ่านการทดสอบแล้วว่ามีประสิทธิภาพดี และเป็นตัวแทนจากแต่ละแหล่งที่เก็บ มาทำการศึกษาวิเคราะห์จำนวน 85 isolate พบว่ามียีน cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1B, cry1C, cry1D, cry1E, และ cry1F ซึ่งเป็นยีนในกลุ่ม cry1-type gene ที่ทราบกันดีว่ามีพิษต่อแมลงใน Order Lepidoptera หรือหนอนผีเสื้อชนิดต่างๆ เชื้อ Bt ส่วนใหญ่จะมี cry gene มากกว่าหนึ่งยีน และส่วนมากเป็นยีน cry IAa, cry IAb และ cry IAc B. thuringiensis สายพันธุ์ TH-28 ซึ่งพบในประเทศไทยและได้เคยผ่านการทดลองแล้วว่ามีประสิทธิภาพดีในการกำจัด หนอนเจาะสมอฝ้าย ได้ถูกนำศึกษาเพื่อวิเคราะห์ยีนที่ควบคุมการสร้างโปรตีนสารพิษ ด้วยการโคลนชิ้นส่วนขนาด 4.8 kb ที่ให้ผลบวกกับ 726 bp EcoRI fragment ของยีน cry1Ab ที่ใช้เป็น probe เข้าไปใน plasmid vector pGEM-32Zf(+) แล้วถ่ายยีนเข้าไปใน E. coli DH5? จากการศึกษาลำดับเบสพบว่าชิ้นส่วน DNA ที่วิเคราะห์มีลำดับเบสขนาด 3913 bp ซึ่งแปลรหัสให้ลำดับกรดอะมิโนสำหรับสังเคราะห์โปรตีนขนาด 133 kDa เมื่อเปรียบเทียบลำดับกรดอะมิโนพบว่าสอดคล้องกับโปรตีน Cry1Ac โดยมีเปอร์เซนต์ homology สูงถึง 98.6 เปอร์เซนต์ จึงคาดว่า cry gene ของ Bt-TH 28 ที่นำมาศึกษานี้เป็นยีน cry1Ac ในการศึกษาการแสดงออกและประสิทธิภาพของยีน cryIAc ของ Bt-TH 28 ด้วยการวิเคราะห์โปรตีนที่เป็นผลผลิตของยีนในเซลล์ E. coli ด้วยวิธี SDS-PAGE, Western immunoblot และ bioassay พบว่าโปรตีนที่ผลิตได้มีน้ำหนักโมเลกุล 130 kDa เป็นโปรตีนสารพิษในกลุ่ม Cry1A และมีความเป็นพิษต่อหนอนเจาะสมอฝ้ายอเมริกัน, H. armigera. เทคนิคการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อฝ้ายและการถ่ายยีนได้ถูกพัฒนาขึ้นในห้องปฎิ บัติการ เพื่อสร้างฝ้ายจำลองพันธุ์ต้านทานต่อหนอนเจาะสมอฝ้าย โครงการนี้ประสพความสำเร็จในการพัฒนาระบบการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อฝ้ายพันธุ์ ศรีสำโรง 60 อย่างครบวงจร ด้วยวิธี somatic embryogenesis ซึ่งรวมทั้งการเตรียมชิ้นส่วนเนื้อเยื่อจำนวนมากๆ เพื่อใช้ในการถ่ายยีน และการเพาะเลี้ยงชิ้นส่วนเนื้อเยื่อที่ได้รับการถ่ายยีนแล้วให้เจริญพัฒนา เป็นต้นฝ้ายที่สมบูรณ์ ทางโครงการได้ถ่าย cry1Ab synthetic gene ซึ่งอยู่ใน binary vector pKYLX71-35S2 เข้าไปในต้นฝ้ายพันธุ์ศรีสำโรง 60 ด้วยวิธี Agrobacterium-mediated transformation การทดลองปรับปรุงสภาพต่างๆ ในการถ่ายยีนและการใช้สารบางชนิดทำให้การถ่ายยีนมีประสิทธิภาพดียิ่งขึ้น ผลจากการถ่าย cry1Ab synthetic gene ได้ kanamycin-resistant calli จำนวน 74 calli ซึ่งมาจาก lines ต่างๆ กัน เนื้อเยื่อทั้งหมดได้ถูกนำมาเพาะเลี้ยงจนเป็นต้นฝ้ายที่สมบรูณ์ ออกดอก ติดสมอและให้เมล็ดตามปกติในโรงเรือนทดลอง การตรวจสอบต้นฝ้ายจำลองพันธุ์ที่ได้รับการถ่ายยีนด้วยเทคนิค PCR พบว่ามีต้นฝ้าย 17 ต้นซึ่งเจริญมาจาก embryogenic calli จำนวน 6 lines ที่ให้ PCR product ขนาดประมาณ 1323 bp ที่เฉพาะกับ cry1Ab gene การวิเคราะห์ด้วยวิธี Southern hybridization พบว่า cry1Ab gene ได้ถูกส่งถ่ายเข้าเชื่อมกับ chromosome ของฝ้ายอย่างน้อยจำนวน 1 หรือ 2 ชุด การทดสอบประสิทธิภาพของฝ้ายที่ได้รับการถ่ายยีนด้วยการทำ Leaf-disc bioassay พบว่าหนอนเจาะสมอฝ้ายที่กินฝ้ายที่ได้รับการถ่ายยีนมีน้ำหนักตัวน้อยกว่า หนอนที่กินฝ้ายปกติ และมีเปอร์เซนต์ตายตั้งแต่ 3.3-62.0 เปอร์เซนต์ โดยต้นฝ้ายจำลองพันธุ์ Line 10/1 มีประสิทธิภาพในการต้านทานต่อหนอนเจาะสมอฝ้ายดีที่สุด การวิเคราะห์ด้วยวิธี Western immunoblot พบว่า ต้นฝ้าย Line 10/1 สร้าง Cry1Ab protein ในระดับ 0.001-0.01 เปอร์เซนต์ของปริมาณโปรตีนทั้งหมดในต้นฝ้าย ผลจากการทดลองสรุปได้ว่าโครงการวิจัยนี้ประสพความสำเร็จในการถ่ายยีนควบคุม การสร้างโปรตีนสารพิษของเชื้อ B. thuringiensis เข้าไปในฝ้ายไทย พันธุ์ศรีสำโรง 60 ด้วยการใช้เชื้อ Agrobacterium การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อฝ้ายด้วยวิธี somatic embryogenesis ที่ได้พัฒนาขึ้นทำให้สามารถเพาะเลี้ยงต้นฝ้ายที่ได้รับการถ่ายยีนให้เจริญ เป็นต้นฝ้ายที่สมบูรณ์ จากการตรวจสอบพบว่าต้นฝ้ายบางต้นสร้างโปรตีนสารพิษของเชื้อ Bt ที่เป็นพิษกับหนอนเจาะสมอฝ้ายอเมริกัน นับเป็นการรายงานครั้งแรกในประเทศไทยเรื่องการสร้างฝ้ายจำลองพันธุ์ด้วยการ ถ่ายยีนจากเชื้อแบคทีเรีย B. thuringiensis เพื่อให้ต้นฝ้ายต้านทานต่อการทำลายของแมลง

บรรณานุกรม :
ทิพย์วดี อรรถธรรม , Tipvadee Attathom . (2541). การพัฒนาการใช้เชื้อ Bacillus thuringiensis ในการสร้างฝ้ายจำลองพันธุ์ต้านทานต่อหนอนเจาะสมอฝ้าย.
    ปทุมธานี : สำนักงานพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติ.
ทิพย์วดี อรรถธรรม , Tipvadee Attathom . 2541. "การพัฒนาการใช้เชื้อ Bacillus thuringiensis ในการสร้างฝ้ายจำลองพันธุ์ต้านทานต่อหนอนเจาะสมอฝ้าย".
    ปทุมธานี : สำนักงานพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติ.
ทิพย์วดี อรรถธรรม , Tipvadee Attathom . "การพัฒนาการใช้เชื้อ Bacillus thuringiensis ในการสร้างฝ้ายจำลองพันธุ์ต้านทานต่อหนอนเจาะสมอฝ้าย."
    ปทุมธานี : สำนักงานพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติ, 2541. Print.
ทิพย์วดี อรรถธรรม , Tipvadee Attathom . การพัฒนาการใช้เชื้อ Bacillus thuringiensis ในการสร้างฝ้ายจำลองพันธุ์ต้านทานต่อหนอนเจาะสมอฝ้าย. ปทุมธานี : สำนักงานพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติ; 2541.