ridm@nrct.go.th   ระบบคลังข้อมูลงานวิจัยไทย   รายการโปรดที่คุณเลือกไว้

การถ่ายทอดยีน chitinase เข้าใน Bacillus thuringiensis เพื่อปรับปรุงสายพันธุ์ให้มีศักยภาพสูงขึ้นในการควบคุมหนอนใยผัก

หน่วยงาน สำนักงานพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติ

รายละเอียด

ชื่อเรื่อง : การถ่ายทอดยีน chitinase เข้าใน Bacillus thuringiensis เพื่อปรับปรุงสายพันธุ์ให้มีศักยภาพสูงขึ้นในการควบคุมหนอนใยผัก
นักวิจัย : จันทร์เพ็ญ วิวัฒน์ , Chanpen Wiwat
คำค้น : Bacillus circulans No. 4.1 , Bacillus thuringiensis , Biological sciences , Chitinase , Diamondback moth , Genes , Genetic transformation , Plant biotechnology , Plant biotechnology and related agricultural science , การปรับปรุงพันธุ์ , ยีน , ศูนย์พันธุวิศวกรรมและเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ , สาขาเกษตรศาสตร์และชีววิทยา , หนอนใยผัก , ไคติเนส
หน่วยงาน : สำนักงานพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติ
ผู้ร่วมงาน : -
ปีพิมพ์ : 2539
อ้างอิง : http://www.nstda.or.th/thairesearch/node/1480
ที่มา : -
ความเชี่ยวชาญ : -
ความสัมพันธ์ : -
ขอบเขตของเนื้อหา : -
บทคัดย่อ/คำอธิบาย :

Bacillus circulans No. 4.1 เป็นจุลินทรีย์ที่แยกได้จากดิน สร้างเอนไซม์ chitinase แบบส่งออกนอกเซลล์ที่ย่อย colloidal chitin ได้ที่ pH 6-11 จึงได้ทดสอบประสิทธิภาพในการฆ่าหนอนใยผัก วัย 2-3 โดยใช้ chitinase ที่สกัดจาก B.circulans No.4.1 ที่ผสมกับเชื้อ Bacillus thuringiensis subsp. Kurstaki (B.t.k.) เปรียบเทียบกับประสิทธิภาพของ B.t.k. เพียงอย่างเดียว จากการเปลรียบเทียบค่า LC50 พบว่า crude chitinase enzyme สามารถเสริมฤทธิ์ delta-endotoxin จากเชื้อ B.t.k. ให้มีประสิทธิภาพสูงขึ้นในการฆ่าหนอนใยผัก โดยค่า LC50 ลดลง จาก 323.33 spores-mm2 เป็น 11.41 spores/mm2 ได้ทำการสกัดแยกเอ็นไซม์ chitinase ให้บริสุทธิ์โดยการตกตะกอนด้วย 80% ammonium sulfate, Sephacel (anion exchage), และ Sephadex G-100 (gel filltration) chromatography ตามลำดับ ได้เอ็นไซม์ที่บริสุทธิ์ 1 ชนิด มีน้ำหนักโมเลกุลประมาณ 45 Kda ศึกษาคุณสมบัติของเอ็นไซม์บางประการ พบว่ามี optimum pH ที่ 8.0 optimum temperature ที่ 40 oC ค่า pl 5.1 และมีลำดับกรดอมิโนทางด้าน N-terminal จำนวน 20 residues ดังนี้ APWNSKGNYALPYYRGAWAV ได้แยกและขยายยีน chitinase จาก B.circulans No.4.1 คัดเลือก clone โดยสังเกตการย่อย 4-MU(GlcNAc)2 ได้ cloneที่มียีนขนาด 3.6 kb (G1) และทำการตัด DNA ให้มีขนาดเล็กลงแต่ยังคงมีการแสดงออกของยีนได้มีขนาด 2.4 kb (pCHIB) แล้วหาลำดับนิวคลีโอไทด์ พบว่ามี 1 open reading frame ระหว่าง nucleotide ที่ 1201-2526 สร้างพลาสมิดลูกผสมที่ประกอบด้วย chitinase gene จาก B.circulans No.4.1 (pHYC1) chitinase gene จาก Pseudomonas maltophilia (pHYB1,pHYB2,pHYB3) และ chitinase gene จาก Aeromonas hydrophila (pHYA1) ในพลาสมิด pHY300PLK แล้ว นำพลาสมิดลูกผสมนี้เข้าสู่ Bacillus subtilis.B.thuringiensis subsp.israelensis c4Q272 โดยวิธี electroporation คัดเลือก transformant และทำการทดสอบยืนยันโดย Southern hybridization และ enyzme activity ศึกษาคุณสมบัติ และการแสดงออกของ chitinase,gene ใน B.t.i. cQ272 พบว่า พลาสมิดลูกผสมสามารถอยู่ได้ใน B. subtilis ในส่วน B.t.i c4Q272 มีแต่ pHYC1 เท่านั้นที่อยู่ได้อย่างสมบูรณ์ ส่วนพลาสมิดลูกผสมอื่นๆ chitinase gene บางส่วนขาดหายไป จากนั้น ทำการถ่ายทอดพลาสมิดลูกผสมจาก B.t.i c4Q272 ไปยัง thuringiensis subsp.kurstaki พบว่า chitinase gene บางส่วนขาดหายไป ดังนั้นจึงได้ นำพลาสมิดลูกผสม pHYC1 เข้าสู่ B. thuringiensis สายพันธุ์ต่างๆ พบว่า pHYC1 สามารถอยู่ได้ใน B.t. aizawai จึงนำไปทดสอบ toxicity ต่อหนอนใยผักเปรียบเทียบกับ B.t.a. อย่างเดียวพบว่าค่า LC50 ของ engineered B.t.a.-pHYC1 (3.1 spores/mm2) ต่ำกว่า B.t.a. สายพันธุ์ดั้งเดิม (25 spores/m m2) นอกจากนั้นได้ทดสอบหาความสามารถในการสร้าง chitinase ของ B. thuringiensis สายพันธุ์ต่างๆ ที่เก็บรักษาไว้ จำนวน 152 isolates โดยการเพาะเลี้ยงบน colloidal chitin agar พบว่า มี เชื้อ B. thuringiensis จำนวน 47 isolates ที่สามารถสร้างเอ็นไซม์ chitinase ได้ โดยปรากฏ clear zone รอบๆโคโลนี

บรรณานุกรม :
จันทร์เพ็ญ วิวัฒน์ , Chanpen Wiwat . (2539). การถ่ายทอดยีน chitinase เข้าใน Bacillus thuringiensis เพื่อปรับปรุงสายพันธุ์ให้มีศักยภาพสูงขึ้นในการควบคุมหนอนใยผัก.
    ปทุมธานี : สำนักงานพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติ.
จันทร์เพ็ญ วิวัฒน์ , Chanpen Wiwat . 2539. "การถ่ายทอดยีน chitinase เข้าใน Bacillus thuringiensis เพื่อปรับปรุงสายพันธุ์ให้มีศักยภาพสูงขึ้นในการควบคุมหนอนใยผัก".
    ปทุมธานี : สำนักงานพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติ.
จันทร์เพ็ญ วิวัฒน์ , Chanpen Wiwat . "การถ่ายทอดยีน chitinase เข้าใน Bacillus thuringiensis เพื่อปรับปรุงสายพันธุ์ให้มีศักยภาพสูงขึ้นในการควบคุมหนอนใยผัก."
    ปทุมธานี : สำนักงานพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติ, 2539. Print.
จันทร์เพ็ญ วิวัฒน์ , Chanpen Wiwat . การถ่ายทอดยีน chitinase เข้าใน Bacillus thuringiensis เพื่อปรับปรุงสายพันธุ์ให้มีศักยภาพสูงขึ้นในการควบคุมหนอนใยผัก. ปทุมธานี : สำนักงานพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติ; 2539.