ridm@nrct.go.th   ระบบคลังข้อมูลงานวิจัยไทย   รายการโปรดที่คุณเลือกไว้

การพัฒนาระบบแสดงโปรตีนบนผิวเซลล์ไซยาโนแบคทีเรีย: การสร้างออร์กาโนฟอสฟอรัสไฮโดรเลสบนผิวเซลล์ Synechococcus PCC7942เพื่อย่อยสลายยาฆ่าแมลงออร์กาโนฟอสเฟต

หน่วยงาน สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย

รายละเอียด

ชื่อเรื่อง : การพัฒนาระบบแสดงโปรตีนบนผิวเซลล์ไซยาโนแบคทีเรีย: การสร้างออร์กาโนฟอสฟอรัสไฮโดรเลสบนผิวเซลล์ Synechococcus PCC7942เพื่อย่อยสลายยาฆ่าแมลงออร์กาโนฟอสเฟต
นักวิจัย : วิภา จึงจตุพรชัย
คำค้น : Cyanobacterial , Degradation , Development , Organophosphorus , Organophosphorus Hydrolase , pesticides , Synechococcus PCC7942 , การพัฒนาระบบ , การสร้างออร์กาโนฟอสฟอรัสไฮโดรเลส , ยาฆ่าแมลง , ย่อยสลาย , ออร์กาโนฟอสเฟต , เซลล์ , โปรตีน , ไซยาโนแบคทีเรีย
หน่วยงาน : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย
ผู้ร่วมงาน : -
ปีพิมพ์ : 2551
อ้างอิง : http://elibrary.trf.or.th/project_content.asp?PJID=BRG4680014 , http://research.trf.or.th/node/2594
ที่มา : -
ความเชี่ยวชาญ : -
ความสัมพันธ์ : -
ขอบเขตของเนื้อหา : -
บทคัดย่อ/คำอธิบาย :

มีการนำโปรตีนที่แสดงออกบนผิวเซลล์ของจุลชีพมาประยุกต์ใช้ทางด้านเทคโนโลยีชีวภาพอย่างกว้างขวาง ตัวอย่างเช่น screening-displayed peptide, whole-cell biocatalysts และ biosensor อย่างไรก็ดี ยังไม่มีรายงานเกี่ยวกับระบบแสดงโปรตีนบนผิวเซลล์ไซยาโนแบคทีเรีย มีการแสดงให้เห็นว่า (i) activated cyanobacteria-reactor เป็นวิธีที่ประหยัดในการบำบัดน้ำเสียจากครัวเรือนหรืออุตสาหกรรม (ii) organophosphorus hydrolase (OPH) สามารถย่อยสลายพิษกลุ่ม Organophophate (OP) ซึ่งมีพิษสูงและใช้เป็นยาฆ่าแมลง (pesticide) ทางเกษตรกรรมและในครัวเรือนอย่างแพร่หลาย ดังนั้นรีคอมบิแนนท์ไซยาโนแบคทีเรียที่สร้าง OPH จึงอาจเป็นวิธีใหม่สำหรับย่อยสลายยาฆ่าแมลง เพื่อพัฒนาะบบแสดงรีคอมบิแนนท์โปรตีนบนผิวเซลล์ไซยาโนแบคทีเรีย ในการศึกษานี้จึงได้ใช้ไซยาโนแบคทีเรีย Synechococcus PCC7942 เป็น model system ในการสร้าง OPH จาก Flavobacterium sp. และ green fluorescent protein (GFP) จาก Aequoea victoia บนผิวเซลล์โดยใช้ Lpp'-Ompa system ของ E.coli หรือ ice nucleation protein ของ Pseudomonas syringae เป็น anchoring motif ได้เปรียบเทียบ OPH activity ของ Synechococcus ที่มียีน opd ซึ่งสร้าง OPH ภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์ λ'PR และ tRNA promoter (P tRNA) พบว่า P tRNA ทำงานแข็งขันกว่า λPR ดังนั้นจึงสร้าง shuttle plasmid ที่มียีน Lpp'OmpA ซึ่ง fused in frame กับยีน opd ภายใต้การควบคุมของ P tRNA แล้ว transformed เข้าสู่ Synechococcus ผลการทดลองแสดงให้เห็นว่ามีการสร้าง opd mRNA แต่ไม่พบ OP activity ดังนั้น gene cassetts P tRNA-(Lpp'-OmpA)-opd ไม่สามารถสร้างโปรตีน OPH เพื่อศึกษาการใช้ ice nucleation protein เป็น anchoring motif จึงสร้าง shuttle plasmid ที่มี gene cassettes สำหรับสร้าง โปรตีนภายในเซลล์ (PtRNA-opd และ PtRNA-gfp) และภายนอกเซลล์ (PtRNA-inaK-opd และ PtRNA-inaK-gfp) แล้ว transformed เข้าสู่ Synechococcus เมื่อตรวจสอบ OPH activity ของเซลล์ที่เลี้ยงในวันต่างๆพบว่าเซลล์ที่เลี้ยงสองวันให้ค่า OPH activity สูงสุด การสร้างโปรตีน OPH ภายในเซลล์หรือบนผิวเซลล์ไม่มีผลกระทบ ต่อการเจริญเติบโต ตรวจสอบ kinetic parameters ของ OPH พบว่าเซลล์สด (frech whole cells) ที่มี PtRNA-opd และ PtRNA-inak-opd มีค่า Vmax เป็น 141.67(+-29.58) และ 2.78(+-0.37) Uniy/L/OD730 ส่วนเซลล์ที่ผ่านการแช่แข็ง (frozen/thawed whole cells) มีค่า Vmax เป็น 477.50(+-51.68) และ 11.04 (+-0.68) Unit/L/OD730 ตามลำดับ เนื่องจากไม่พบ OPH activity ใน cell lysate ของเซลล์ที่มี PtRNA-inaK-opd จึงบ่งชี้ว่ามีการสร้างโปรตีน OPH บนผิวเซลล์ เท่านั้น ได้เตรียม anti OPH polyclonal antibody ในหนู โดยใช้ antigen คือ GST-OPH fusion protein ที่สกัดบริสุทธิ์ จาก E.coli ที่มี GST-opd fufion gene ได้ใช้ antibody ดังกล่าวทำปฎิกิริยากับ OPH ที่สร้างบนผิวเซลล์ แล้วตรวจสอบโดยใช้ diaminobenzdine และส่งดูโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ชนิดส่องกราดด้วยเลเซอร์ (CLSM) ผลการทดลองบ่งชี้ว่ามี OPH อยู่บนผิวเซลล์ที่มี PtRNA-inaK-opd นอกจากกนี้การทดลอง proteinase accessibility assay ก็ยืนยันว่ามี OPH อยู่บนผิวเซลล์ เนื่องจากสามารถตรวจพบ OPH activity ในเซลล์ที่มี PtRNA-opd ซึ่งสร้างโปรตีน OPH ภายในเซลล์ แสดงให้เห็นว่า substrate (paraoxon) สามารถผ่าน ผิวเซลล์ไซยาโนแบคทีเรีย ผลการใช้ CLSM แสดงให้เห็นว่าโปรตีน GFP เกือยทั้งหมดอยู๋ใน periplasm ของ Synechococcus ที่มี PtRNA-inaK-gfp และพบ GFP immune complexes เพียงเล็กน้อยบนผิวเซลล์ มองเห็นไม่ชัดนัก สาเหตุอาจเนื่องจาก GFP ไม่เหมือน OPH ที่ไม่ใช่โปรตีนที่เกี่ยวข้องกับ membrane Microbial cell surface display has a wide range of biotechnological applications, for examples: screening-displayed peptide libraries, whole-cell biocatalysts and biosensor. So far, there is no report concerning surface display system in cyanobacteria. It nas been show that: (i), the activated cyanobacteria-reactor is an economical method for treating both domestic and industrial wastewater; (ii), organophosphorus hydrolase (OPH) can effectively detoxify organnophorus compounds which are highly toxic and used extensively as agricultural and domestic pesticides. Therefore, recombinant cyanobacteria expressed OPH could be used as a novel method for biodegradation of pesticides. In this study, in order to develop a system to display recombinant proteins in cyanobacteria, Synechococcus PCC7942 was used as a model system to surface display the OPH of Flavobacterium sp. and the green fluorescent protein (GFP) of Aequorea victoria by using the Lpp'-OmpA system of E. coil or ice nucleation protein of Pseudomonas syringae as anchoring motif. Comparison of OPH activities of Synechococcus harboring the opd gene encoding OPH under the control of ?PR promoter and tRNA promoter (P tRNA) indicated that P tRNA is stronger than ?PR. Therefore, the shuttle plasmid containing Lpp'-OmpA gene fused in frame with the opd gene under the control of P tRNA was constructed and transformed into Synechococcus. Results revealed that the opd mRNA was transcribed, however, no OPH activity was detected. Thus, the gene cassette P tRNA-(Lpp'-OmpA)-opd was not able to expressed functional OPH protein. Tostudy the ice nucleation protein as anchoring motif, the shuttle plasmids containing gene cassettes for intracellular (P tRNA- and P tRNA-gfp) and surface-expressed (P tRNA-inaK-opd and P tRNA-inaK-gfp) proteins were constructed and transformed into Synechococcus. Determination of OPH activity of cuitures at various intervals revealed that the two-days cultures of recombinant Synechococcus expressed highest OPH activity.Expression of OPH protein either intracellular or on cell surface had no effect on cell growth. Investigation of kinetic parameters OPH showed that the Vmax of fresh whole cells harboring P tRNA-opd and P tRNA-inaK-opd were 141.67(?29.58) and 2.78(?0.37) Unit/L/OD730; frozen/thawed whole cells, 477.50(?51.86) and 11.04(?0.68) Unit/L/OD730, respectively. NO OPH activity was deteced in cell lysate ofcell harboring P tRNA-inaK-opd, therefore, the OPH was only expressed on cell surface. The mouse anti OPH polyclonal antibody, obtained by using the GST-OPH fusion protein purified from E. coil harboring GST-opd fusion gene as antigen,was used to react with surfaced expressed OPH; reactivity of immune complexes was visualized using diaminobenzidine under confocal laser scanning microscopy (CLSM). Results showed that OPH was surface expressed on Synechococcus harboring P tRNA-inaK-opd. In addition, proteinase accessibility assay also confirmed the presence surface expressed OPH. The OPH activity was detected in cells (P tRNA-opd) with intracellular OPH protein, indicating that the substrate (paraoxon) was able to transport across the cyanobacterial cell wall. CLSM revealed GFP to be almost exclusively located in the periplasm of Synechococcus harboring P tRNA-inaK-gfp, the reactivity of GFP immune complexes was barely detectable on Synechococcus cell surface. This might be due to the fact that GFP, unlike OPH, is not membrane associated protein.

บรรณานุกรม :
วิภา จึงจตุพรชัย . (2551). การพัฒนาระบบแสดงโปรตีนบนผิวเซลล์ไซยาโนแบคทีเรีย: การสร้างออร์กาโนฟอสฟอรัสไฮโดรเลสบนผิวเซลล์ Synechococcus PCC7942เพื่อย่อยสลายยาฆ่าแมลงออร์กาโนฟอสเฟต.
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย.
วิภา จึงจตุพรชัย . 2551. "การพัฒนาระบบแสดงโปรตีนบนผิวเซลล์ไซยาโนแบคทีเรีย: การสร้างออร์กาโนฟอสฟอรัสไฮโดรเลสบนผิวเซลล์ Synechococcus PCC7942เพื่อย่อยสลายยาฆ่าแมลงออร์กาโนฟอสเฟต".
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย.
วิภา จึงจตุพรชัย . "การพัฒนาระบบแสดงโปรตีนบนผิวเซลล์ไซยาโนแบคทีเรีย: การสร้างออร์กาโนฟอสฟอรัสไฮโดรเลสบนผิวเซลล์ Synechococcus PCC7942เพื่อย่อยสลายยาฆ่าแมลงออร์กาโนฟอสเฟต."
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย, 2551. Print.
วิภา จึงจตุพรชัย . การพัฒนาระบบแสดงโปรตีนบนผิวเซลล์ไซยาโนแบคทีเรีย: การสร้างออร์กาโนฟอสฟอรัสไฮโดรเลสบนผิวเซลล์ Synechococcus PCC7942เพื่อย่อยสลายยาฆ่าแมลงออร์กาโนฟอสเฟต. กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย; 2551.