ridm@nrct.go.th   ระบบคลังข้อมูลงานวิจัยไทย   รายการโปรดที่คุณเลือกไว้

การศึกษาระดับโมเลกุลและสรีรวิทยาของยีนซึ่งมีความสัมพันธ์กับการตอบสนองต่อ Peroxidase stress ในเชื้อ Xanthomonas

หน่วยงาน สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย

รายละเอียด

ชื่อเรื่อง : การศึกษาระดับโมเลกุลและสรีรวิทยาของยีนซึ่งมีความสัมพันธ์กับการตอบสนองต่อ Peroxidase stress ในเชื้อ Xanthomonas
นักวิจัย : ศกรณ์ มงคลสุข
คำค้น : analysis , Genes , Molecular , Peroxidase stress , physiology , Xanthomonas , การศึกษา , ยีน , สรีรวิทยา , โมเลกุล
หน่วยงาน : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย
ผู้ร่วมงาน : -
ปีพิมพ์ : 2546
อ้างอิง : http://elibrary.trf.or.th/project_content.asp?PJID=BRG4380010 , http://research.trf.or.th/node/2578
ที่มา : -
ความเชี่ยวชาญ : -
ความสัมพันธ์ : -
ขอบเขตของเนื้อหา : -
บทคัดย่อ/คำอธิบาย :

คณะผู้วิจัยได้ทำการแยกยีน katA ของแบคทีเรีย Xanthomonas campestris pv. phaseoli ซึ่งเป็นยีนที่ code เอ็นไซม์ monofunctional catalase โดยใช้วิธี reverse genetic ด้วยการออกแบบ degenerate primers จากลำดับกรดอะมิโนที่ conserved และได้ใช้ primers ดังกล่าวทำ PCR โดยใช้ genomic DNA ของแบคทีเรีย X. campestris pv. phaseoli เป็นต้นแบบ จากการ PCR ทำให้ได้ DNA fragment ขนาด 344 bp ซึ่งต่อมาได้นำเอา DNA fragment นี้มาเป็น probe โดยการติดฉลากด้วยสารรังสี 32P เพื่อนำไปใช้ในการหายีน katA จากห้องสมุด DNA ของ X. campestris pv. phaseoli ที่สร้างขึ้นใน -ZipLox phages จากการ screen โดยใช้ plague hybridization ทำให้ได้พลาสมิค pKat29 ที่มี katA เต็มยีน เมื่อวิเคราะห์จากลำดับเบสของยีน katA พบว่ายีนนี้มีขนาด 1521 bp สำหรับสร้างโปเมื่อรตีนขนาด 56kDa เมื่อนำโปรตีน katA ที่ purified จากแบคทีเรียกลายพันธ์ที่สร้าง KatA ในปริมาณสูงมาทำการวิเคราะห์ทางชีวเคมีพบว่ามีค่า apparent Km and Vmax เท่าหับ 39 mM of H2O2 and 2.3 * 10^5 umol/min/mg protein ตามลำดับ มีค่า kcat at Vmax point is 2.132*10^5 sec-1 และมีความไวต่อสาร 3 Amino-1,2,4 Triazole เหมือนกับ typical catalase ทั่วไป จากการสร้าง phtlogenetic tree โดยใช้ลำดับกรดอะมิโนของ catalase จากสิ่งมีชีวิตต่างๆ ใน database พบว่า KatA จัดอยู่ในประเภท bacteria group1 เพื่อศึกษาถึงบทบาทของ KatA ต่อการอยู่รอดของแบคทีเรียภายใต้สภาวะที่มีอนุมูลอิสระ ออกซิเจนสูง คณะผู้วิจัยจึงได้สร้างแบคทีเรียกลายพันธ์ที่ไม่สามารถสร้าง KatA ได้โดยวิธี insertional inactivation จากชิ้นส่วนของยีน katA ที่อยู่ในพลาสมิคที่ไมาสามารถแบ่งตัวเพิ่มจำนวนได้ใน X. campestris pv. phaseoli เมื่อนำ katA mutant ไปศึกษาพบว่า ระดับของ total catalase activity ลดลงอย่างมากในช่วง log phase เมื่อนำไปทดสอบการต้านทานต่อสาร peroxide ต่างๆพบว่า katA mutant ไวต่อสาร H2O2 อย่างมาก แสดงให้เห็นว่า KatA มีความสำคัญต่อการอยู่รอดของแบคทีเรียในสภาวะที่มี H2O2 ในการวิเคราะห์การแสดงออกของยีน katA โดยวิธี Northern blot bybridization พบว่า การแสดงออกของยีนนี้ สามารถถูกเหนี่ยวนำได้เมื่อแบคทีเรียสัมผัสต่อสารประเภท oxidants เช่น H2O2 organic hydroperoxide และ menadione โดยการแสดงออกนี้ อยู่ภายใต้การควบคุมของ oxyR ซึ่งเป็น a global peroxide sensor and transcription regulator นอกจากนี้ยังพบว่า katA ถูก transcribed เป็น polycistronic RNA ร่วมกับโปรตีนอีกชนิดหนึ่งที่อยู่ใกล้เคียงที่มีชื่อว่า ankyrin like protein Xanthomonas campestris pv. phaseoli katA, the gene for major monofunctional catalase was cloned using the reverse genetic technique. Two degenerated primers were designed from a partial amino acid sequences of KatA in Xp and from the conserved region of monofunctional catalases. The PCR using degenerate primers and Xp genomic DNA was done and giving 344 bp-PCR product that was used as a DNA probe to screen a full length katA gene from Xp genomic library -ZipLox phages by plaque hybridization. A complete positive clone was named pKat29 containing complete seqauence of katA . An open reading frame of 1,521 bp, encoding a protein of 507 amino acid with theoretical molecular weight about 56 kDa. The apparent Km and Vmax values are about 39 mM of H2O2 and 2.3*10^5 sec-1. Both KatA from Xpw/t and XpHR were sensitive to 3 Amino-1,2,4 Triazole. They are unusual catalase in several respects, including the apparent of narrower pH optimal and less heat stable than normal tetrameric catalase. The Xp KatA is classified in the bacteria group I from the results of amino acid sequences similarity to all principal monofunctional catalase. To examine the Xp katA's role against oxidative strass, katA mutant was constructed by insertional inactivation using a peice of katA inserted into non-replicated plasmid. Xp katA mutant was ascertained by Southern analysis and catalase activity gel staining. The mutant produced significantly decreased level of total catalase activity at log phase of growth, and bacame extremely sensitive to H2O2 killing comparing with the wild type strain. Thus, all results suggest the katA played an important role in Xp against oxidative stress by detoxification of exogenous H2O2. Expression analyses by Northern blot hybridization revealed that katA was transcribed as a polycistronic RNA with the adjacent protein called ankyrin like protein. The expression of katA could be induced by exposure to oxidants including H2O2, organic hydroperoxide and particularly menadione and was mediated by oxyR, a global peroxide sensor and transcription regulator.

บรรณานุกรม :
ศกรณ์ มงคลสุข . (2546). การศึกษาระดับโมเลกุลและสรีรวิทยาของยีนซึ่งมีความสัมพันธ์กับการตอบสนองต่อ Peroxidase stress ในเชื้อ Xanthomonas.
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย.
ศกรณ์ มงคลสุข . 2546. "การศึกษาระดับโมเลกุลและสรีรวิทยาของยีนซึ่งมีความสัมพันธ์กับการตอบสนองต่อ Peroxidase stress ในเชื้อ Xanthomonas".
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย.
ศกรณ์ มงคลสุข . "การศึกษาระดับโมเลกุลและสรีรวิทยาของยีนซึ่งมีความสัมพันธ์กับการตอบสนองต่อ Peroxidase stress ในเชื้อ Xanthomonas."
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย, 2546. Print.
ศกรณ์ มงคลสุข . การศึกษาระดับโมเลกุลและสรีรวิทยาของยีนซึ่งมีความสัมพันธ์กับการตอบสนองต่อ Peroxidase stress ในเชื้อ Xanthomonas. กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย; 2546.