ridm@nrct.go.th   ระบบคลังข้อมูลงานวิจัยไทย   รายการโปรดที่คุณเลือกไว้

การตรวจสอบและการแยกยีนที่เกี่ยวข้องกับความรุนแรงในการก่อโรคของมาร์เนฟฟิไอขณะที่ติดเชื้อภายในแมคโครฟาจ

หน่วยงาน สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย

รายละเอียด

ชื่อเรื่อง : การตรวจสอบและการแยกยีนที่เกี่ยวข้องกับความรุนแรงในการก่อโรคของมาร์เนฟฟิไอขณะที่ติดเชื้อภายในแมคโครฟาจ
นักวิจัย : นงนุช วณิตย์ธนาคม
คำค้น : Cu , macrophage , P. marneffei , phagocytosis , PMNs , Zn SOD
หน่วยงาน : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย
ผู้ร่วมงาน : -
ปีพิมพ์ : 2549
อ้างอิง : http://elibrary.trf.or.th/project_content.asp?PJID=BGJ4680013 , http://research.trf.or.th/node/1914
ที่มา : -
ความเชี่ยวชาญ : -
ความสัมพันธ์ : -
ขอบเขตของเนื้อหา : -
บทคัดย่อ/คำอธิบาย :

เชื้อราสองรูปเพนนิซิเลียมมาร์เนฟฟิไอเป็นเชื้อที่สามารถก่อโรคที่พบมากในเขตเอเชียตะวันออกเฉียงใต้ ซึ่งจะพบการติดเชื้อในผู้ที่มีภาวะภูมิคุ้มกันทางด้านเซลล์บกพร่องโดยเฉพาะผู้ป่วยที่ติดเชื้อไวรัสเอชไอวี การสัมผัสและการรับเชื้อที่ทำให้เกิดโรคนั้นยังไม่ทราบกลไกที่แน่นอน เมื่อเทียบกับเชื้อฉวยโอกาสชนิดอื่นพบว่าอาจจะมีการรับเชื้อที่คล้ายกันนั่นคือการหายใจเอาสปอร์ของเชื้อที่อยู่ในอากาศเข้าไปในปอดซึ่งในภาวะที่ผู้ป่วยมีภูมิคุ้มกันบกพร่องก็อาจทำให้เกิดการแพร่กระจายของเชื้อได้ โดยพบว่าขณะที่เกิดการติดเชื้อนั้น ภูมิคุ้มกันแบบไม่จำเพาะมีบทบาทสำคัญในการกำจัดเชื้อ ในการศึกษาครั้งนี้ได้ทำการศึกษาถึงการกินและการฆ่าเชื้อโดยเซลล์เม็ดเลือดขาวคนและแมคโครฟาจของหนูชนิด J774.1 ต่อสปอร์ของเชื้อเพนนิซิเลียมมาร์เนฟฟิไอในหลอดทดลอง ทำการติดฉลากสปอร์ของเชื้อเพนนิซิเลียมมาร์เนฟฟิไอด้วยการให้เชื้อได้รับสาร calcein-AM จากนั้นเชื้อจะใช้เอนไซม์ตัดสารนี้เพื่อให้ได้ calcein ซึ่งเป็นสารเรืองแสงที่ไม่สามารถผ่านเยื่อหุ้มเซลล์ออกมาได้ จากนั้นผสมสปอร์และเซลล์เม็ดเลือดขาวที่อยู่ในพลาสมาซึ่งเตรียมจากเลือดคนที่ตกตะกอนเอาเม็ดเลือดแดงออกโดยใช้สาร dextran หรือผสมกับเซลล์ของหนูชนิด J774.1 สำหรับการทดลองนั้นจะใช้วิธีวิเคราะห์โดยใช้ flow cytometry การตรวจนับภายใต้กล้องจุลทรรศน์ และ การนับจำนวนเชื้อบนอาหารเลี้ยงเชื้อ ผลการทดลองพบการกินเชื้ออย่างมีประสิทธิภาพของเซลล์เม็ดเลือดขาวของคนชนิด polymorphonuclear (PMN) โดยผลจาก flow cytometry พบว่ามีการกินตั้งแต่เริ่มการทดลองใน 5 นาทีแรกและจะเกิดการกินสูงสุดที่ 30 นาทีหลังจากการบ่ม ที่ 37oC ผลจากการนับเชื้อภายใน PMN ภายใต้กล้องจุลทรรศน์ พบว่าจะอยู่ในช่วง 0-7 สปอร์ต่อเซลล์ ส่วน J774.1 จะเป็น 0-10 สปอร์ต่อเซลล์ หลังจากการคำนวณพบว่าค่า percentage of phagocytosis หรือ PP ของการทดลองด้วย PMN ที่ 30 นาที จะเป็น 34% และสูงสุดคือ 53% ที่ 60 นาที และค่า phagocytic index จะเท่ากับ 1.5 และ 1.8 ตามลำดับ นอกจากนี้การฆ่าเชื้อจะเป็น 35% หลังจากการทดลองผ่านไป 30 นาทีโดยใช้การนับเชื้อบนอาหารเลี้ยงเชื้อ อัตราการฆ่าเชื้อจะเท่ากับ 38% และ 50% หลังจากทำการทดลอง 60 และ 120 นาทีตามลำดับ ซึ่งในการทดลองจะใช้อัตราส่วนเซลล์และสปอร์ของเชื้อเป็น 1:1 ผลการทดลองของ J774.1 พบว่ามีค่า PP เท่ากับ 56% ที่เวลา 15 นาที และสูงสุด 99% ที่เวลา 120 นาที ค่า PI ที่ได้จากการทดลองเป็น 1.3 และ 9.1 ตามลำดับ ผลการทดลองการฆ่าเชื้อพบว่าสปอร์ 1.7% จะถูกฆ่าภายในเวลา 15 นาทีแรกและเพิ่มขึ้นเป็น 16.4% และ 24% หลังจาก 120 และ 180 นาทีตามลำดับ ผลการทดลองที่ได้จากการทดสอบภายในหลอดทดลอง phagocytosis และการฆ่าเชื้อโดยเม็ดเลือดขาวของคนชนิด PMNs และ แมคโครฟาจของหนูชนิด J774.1 ต่อสปอร์ของเชื้อเพนนิซิเลียมมาร์เนฟฟิไอ แสดงให้เห็นว่าบทบาทของ PMNs และ แมคโครฟาจต่อการกำจัดสปอร์ของเชื้อเป็นกระบวนการที่สำคัญในการตอบสนองของภูมิคุ้มกันต่อเชื้อนี้ นอกจากการศึกษาการกินและฆ่าเชื้อแล้ว ในการศึกษาครั้งนี้ยังทำการแยกยีนที่เกี่ยวข้องกับความรุนแรงในการก่อโรคซึ่งได้แก่ Cu, Zn superoxide dismutase (Cu, Zn SOD) ซึ่งได้จากการตรวจสอบใน cDNA library ของเชื้อเพนนิซิเลียมมาร์เนฟฟิไอ ด้วยท่อนของยีนที่ได้จากการทำ RT-PCR ด้วย degenerate primers ผลการทดลอง ได้ 13 clone ที่มียีนที่ต้องการ พบว่าหนึ่งในนั้นมีท่อนที่ยาวที่สุดของยีนนี้ซึ่งมีขนาด 467 นิวคลีโอไทด์ โดยพบส่วน open reading frame ที่มีจุดเริ่มที่ ATG และหยุดที่ TAA และเมื่อวิเคราะห์ถึงโพลีเปปไทด์พบว่าประกอบด้วย 154 อะมิโนที่ไม่มีส่วนของ signal peptide โดยจะมี His อยู่ 6 ตำแหน่ง และ Asp 1 ตำแหน่งซึ่งจะทำหน้าที่ในการจับกับ metal เมื่อเทียบกับยีนนี้ในเชื้อราอื่น สำหรับการทดลองเพื่อดูการแสดงออกของยีนที่แต่งต่างกันในขณะที่มีการเปลี่ยนรูปของเชื้อรานี้โดยวิธี RT-PCR พบว่าจะมีการสร้างยีน Cu, Zn SOD ในสภาวะที่เป็นสปอร์ของเชื้อ และสร้างลดลงขณะที่เชื้องอกออกเป็นสายรา ที่ 25oC และหลังจากที่เชื้อเปลี่ยนรูปเป็นยีสต์ที่ 37oC พบว่ามีการสร้างยีนนี้มากขึ้น จากผลการทดลองแสดงให้เห็นว่า Cu, Zn SOD อาจเป็นยีนที่สำคัญในการที่เชื้อสร้างขึ้นเพื่อตอบสนองต่อสภาวะแวดล้อมที่กดดันและการปรับตัวของเชื้อขณะที่เปลี่ยนรูปไปเป็นยีสต์ และยีนนี้อาจจะเป็นยีนที่เกี่ยวข้องกับความรุนแรงในการก่อโรคของเชื้อเพนนิซิเลียมมาร์เนฟฟิไอต่อการเจริญในเซลล์คน Penicillium marneffei, a dimorphic fungus endemic in Southeast Asia, can cause disease in those with impaired cell-mediated immunity, especially in people infected with human immunodeficiency virus. The types of exposure and the route of entry of P. marneffei leading to infection in humans are still unclear. By analogy with other opportunistic fungal pathogens, it seems quite likely that conidia may be inhaled from a contaminated environment and subsequently disseminated from the lungs when immunosuppression occurs in host’s condition. During infection, nonspecific immunity plays a major role in the clearance of this pathogen. In this study, we examined phagocytosis and killing activity of human peripheral blood leukocytes and mouse macrophage cells J774.1 to conidia of P. marneffei in vitro. Conidia of P. marneffei were labeled by allowing uptake and cleavage of calcein-AM to its membrane-impermeable fluorescent derivative, calcein. The conidia were added to cell-rich plasma obtained after dextran sedimentation of erythrocytes from the whole blood or J774.1 cell culture suspension. Phagocytosis and killing assays were determined by using flow cytometry, microscopy and viable colony plate count. Results indicated a high efficiency in phagocytosis effect of polymorphonuclear cells (PMN) against the conidia of P. marneffei. By using flow cytometry, the phagocytosis occurred when the conidia were incubated with the leukocytes for 5 min at 37oC, and reached at maximum after 30 min. From microscopic observation, the number of conidia, which were phagocytosed by one PMN and J774.1 cell, was about 0-7 and 0-10. The percentage of phagocytic (PP) of PMN at 30 min was 34% and reached to the maximum of 53% at 60 min and phagocytic index (PI) was 1.5 and 1.8, respectively. Moreover, phagocytes killed conidia about 35% after 30 min of incubation using viable colony count method. The killing rates increased to approximately 38% and 50% after 60 min and 120 min of incubation, respectively, when the ratio of conidia and phagocytes in the experiment was about 1:1. The PP of J774.1 cells at 15 min was 56% and reached to the maximum of 99% at 120 min and PI was 1.3 and > 9.1, respectively. The 1.7% of conidia was killed at 15 min and the killing rate increased to approximately 16.4% and 24% after 120 and 180 min of incubation, respectively. The collective results of this study of in vitro phagocytosis and anti-fungal activity of PMNs from human peripheral blood leukocytes and mouse macrophages J774.1 against the conidia of P. marneffei suggests that PMNs and macrophages play a crucial role in the early immune response to this fungal pathogen. Moreover, we also studied the Cu, Zn superoxide dismutase gene (Cu, Zn SOD) of P. marneffei. Clones containing complementary deoxyribonucleic acid (cDNA) encoding Cu, Zn SOD were isolated by screening a yeast-phase expression cDNA library of P. marneffei with fragment of RT-PCR product with degenerate primers as a probe. Thirteen positive signals were screened further for a putative full-length clone, a full length 462-nt Cu, Zn SOD cDNA clone was isolated and characterized. An open reading frame of Cu, Zn SOD composed 462 nucleotide was delimited by well-known start (ATG) and stop (TAA) codons. The polypeptide consisted of 154 amino acid that lacked a signal peptide. It contained six His and one Asp residues, which acted as the metal binding ligands in other fungal Cu, Zn SODs. Differential expression of Cu, Zn SOD gene in P. marneffei was demonstrated by reverse trascription polymerase chain reaction (RT-PCR). The Cu, Zn SOD accumulated in conidia (the dormant of organism) and downregulated during the development to mycelia phase at 25oC. The transcript was upregulated in reponse to the yeast phase transition to 37oC. These results indicated that Cu, Zn SOD might play an important role in environmental stress response and adaptation of P. marneffei during yeast phase transition. It may also be a putative virulence factor of P. marneffei for survival in the host cells.

บรรณานุกรม :
นงนุช วณิตย์ธนาคม . (2549). การตรวจสอบและการแยกยีนที่เกี่ยวข้องกับความรุนแรงในการก่อโรคของมาร์เนฟฟิไอขณะที่ติดเชื้อภายในแมคโครฟาจ.
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย.
นงนุช วณิตย์ธนาคม . 2549. "การตรวจสอบและการแยกยีนที่เกี่ยวข้องกับความรุนแรงในการก่อโรคของมาร์เนฟฟิไอขณะที่ติดเชื้อภายในแมคโครฟาจ".
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย.
นงนุช วณิตย์ธนาคม . "การตรวจสอบและการแยกยีนที่เกี่ยวข้องกับความรุนแรงในการก่อโรคของมาร์เนฟฟิไอขณะที่ติดเชื้อภายในแมคโครฟาจ."
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย, 2549. Print.
นงนุช วณิตย์ธนาคม . การตรวจสอบและการแยกยีนที่เกี่ยวข้องกับความรุนแรงในการก่อโรคของมาร์เนฟฟิไอขณะที่ติดเชื้อภายในแมคโครฟาจ. กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย; 2549.