วิทยานิพนธ์ (วท.ม.)--จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย, 2545

ฟีนอลออกซีเดสเป็นเอนไซม์ที่เกี่ยวข้องกับกลไกการป้องกันตนเอง ของสัตว์ในกลุ่มครัสเตเชียนและแมลง ฟีนอลออกซีเดสจะทำหน้าที่เปลี่ยนสารประกอบฟีนอลเป็นควินโนน แล้วจึงเกิดกระบวนการโพลิเมอร์ไรเซชั่นเป็นเมลานิน ซึ่งกระบวนการดังกล่าวจะมีการสร้างสารที่ยับยั้ง การเจริญของจุลินทรีย์ที่มารุกรานได้ ในปัจจุบันมีการนำค่าแอคติวิตีของฟีนอลออกซีเดส มาใช้เป็นดัชนีวัดประสิทธิภาพของระบบภูมิคุ้มกัน การวัดแอคติวิตีของฟีนอลออกซีเดสทางเคมี ได้นำมาใช้ในสัตว์กลุ่มครัสเตเชียนหลายชนิด อย่างไรก็ตามในกรณีของกุ้งนั้น ปัญหาที่พบจากการวัดแอคติวิตีของฟีนอลออกซีเดสโดยวิธีดังกล่าวคือ ตัวอย่างที่ใช้สูญเสียแอคติวิตีได้ง่ายทำให้ผลที่ได้ไม่น่าเชื่อถือ งานวิจัยครั้งนี้ได้พัฒนาวิธีการวัดแอคติวิตีของฟีนอลออกซีเดสในกุ้งกุลาดำ 3 วิธี ได้แก่ วิธีทางเคมี วิธีทางอิมมูนวิทยา และวิธีทางชีววิทยาโมเลกุล โดยวิธีทางเคมีใช้ L-dihydroxyphenyl alanine (L-DOPA )เป็นสับสเตรตซึ่งผลที่ได้แสดงให้เห็นว่าบัฟเฟอร์ที่เหมาะสมที่สุด คือ CAC buffer ที่พีเอช 7-8 การเติมเอนไซม์ทริปซินจะให้ค่าแอคติวิตีของฟีนอลออกซีเดสสูงกว่าไม่มีการเติมทริปซิน 6 เท่า การเติมสาร 3-Methyl-2-Benzothiazolinone Hydrazone (MBTH) ลงไปในปฏิกิริยาจะช่วยเพิ่มความไวในการวัดได้ถึง 3.5 เท่า เมื่อเทียบกับวิธีที่ไม่มีการเติม MBTH วิธีการตรวจฟีนอลออกซีเดสทางอิมมูนวิทยา ได้สร้างโพลีโคลนอลแอนติบอดีของฟีนอลออกซีเดส ซึ่งในการแยกฟีนอลออกซีเดสจากสารละลาย HLS โดยโพลีอะคริลาไมด์เจลอิเลคโตรโฟเรซิสแบบโปรตีนไม่สูญเสียสภาพธรรมชาติ และวิธี affinity chromatography ไม่ประสบผลสำเร็จ เนื่องจากปริมาณโปรฟีนอลออกซีเดสที่แยกได้มีน้อย ไม่เพียงพอที่จะนำไปใช้ผลิตแอนติบอดี ดังนั้นจึงโคลนและชักนำให้เกิด การสังเคราะห์รีคอมบิแนนท์โปรฟีนอลออกซีเดสด้วยเวคเตอร์ pET17b ในแบคทีเรีย Escherichia coli สายพันธุ์ BL21(DE3)plysS นำรีคอมบิแนนท์โปรฟีนอลออกซิเดสไปสร้างแอนติบอดีโดยการฉีดเข้ากระต่าย เมื่อตรวจสอบด้วยวิธีเวสเทอร์นบลอท พบว่าแอนติบอดีที่ได้สามารถจับกับฟีนอลออกซีเดสจากกุ้งกุลาดำได้ สำหรับวิธีทางชีววิทยาโมเลกุลทำโดยเทคนิค semi-quantitative RT-PCR เพื่อตรวจหาระดับของการแสดงออกของยีนโปรฟีนอลออกซีเดส ในการศึกษาครั้งนี้นอกจากการพัฒนาวิธีการตรวจวัดฟีนอลออกซีเดสแล้ว ยังได้มีการนำวิธีการที่พัฒนาได้ทั้ง 3 วิธีดังกล่าวไปทดสอบเบื้องต้น โดยนำไปวัดฟีนอลออกซีเดสในกุ้งกุลาดำปกติ และกุ้งกุลาดำที่ติดเชื้อ Vibrio harveyi ซึ่งผลที่ได้จากวิธีตรวจวัดทั้ง 3 แบบ ให้ผลสอดคล้องกัน