ridm@nrct.go.th   ระบบคลังข้อมูลงานวิจัยไทย   รายการโปรดที่คุณเลือกไว้

วิทยาภูมิคุ้มกันเพื่อวินิจฉัยโรคติดเชื้อ และ การพัฒนาวัคซีนป้องกันโรคอหิวาต์ชนิดกิน

หน่วยงาน สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย

รายละเอียด

ชื่อเรื่อง : วิทยาภูมิคุ้มกันเพื่อวินิจฉัยโรคติดเชื้อ และ การพัฒนาวัคซีนป้องกันโรคอหิวาต์ชนิดกิน
นักวิจัย : วันเพ็ญ ชัยคำภา
คำค้น : adjuvants , cholera , Diagnosis , ELISA , enterohemorrhagic Escherichia coli , genetic engineering , hybridoma , Leptospirosis , Leptospisa spp. , monoclonal antibodies , Shiga toxin , vaccine , Vibrio cholerae , การวินิจฉัยโรค , พันธุวิศกรรม , วัคซีน , สารพิษชิกาเชื้ออหิวาต์ ( วิบริโอ คอเรอเร ) , อีไลซา , เชื้อเลปโตสไปรา , เชื้อเอ็นเทอโรฮีโมราจิก , เอชเชอริเชียโคไล , แอ๊ดจูแวนท์ , โมโนโคลนาลแอนติบอดี , โรคอหิวาต์ , โรคเลปโตสไปโรซีส ( โรคฉี่หนู ) , ไฮบริโดมา
หน่วยงาน : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย
ผู้ร่วมงาน : -
ปีพิมพ์ : 2548
อ้างอิง : http://elibrary.trf.or.th/project_content.asp?PJID=RTA4380007 , http://research.trf.or.th/node/1681
ที่มา : -
ความเชี่ยวชาญ : -
ความสัมพันธ์ : -
ขอบเขตของเนื้อหา : -
บทคัดย่อ/คำอธิบาย :

โครงการย่อยที่ 1 การพัฒนาชุดตรวจสำเร็จรูปสำหรับวินิจฉัยโรคเลปโตสไปโรซีส คณะผู้วิจัยได้เพาะเลี้ยงเซลล์ไฮบริโดมาโคลน LF9 และ LD5 ซึ่งผลิตและหลั่งโมโนโคลนาลแอนติบอดี ( MAb ) ต่อเชื้อในจีนัสเลปโตสไปรา ( genus Leptospira ) และเชื้อเลปโตสไปราและมีความเฉพาะต่อโปรตีนของเชื้อเลปโตสไปราซึ่งมีขนาด 38 กิโลดัลตันและ 35-36 กิโลดัลตัน ตามลำดับ คณะผู้วิจัยได้ใช้ MAb จากโคลน LD5 ( MabLD5 ) เป็นเครื่องมือในการค้นหาและจับแอนติเจนเฉพาะของเชื้อเลปโตสไปราสายพันธุ์ที่ก่อโรคในตัวอย่างสิ่งส่งตรวจ ( specimens )จากผู้ป่วยและตัวอย่างจากวัวโดยได้พัฒนาเป็นชุดตรวจที่ใช้หลักการของ dot-blot ELISA และ sandwich ELISA สำหรับตัวอย่างจากมนุษย์ที่ใช้ตรวจหาแอนติเจนของเลปโตสไปรานั้นมีทั้งปัสสาวะ ซีรัม พลาสมา และพลาสมา + buffy coat โดยได้ตัวอย่างผู้ป่วยจากโรงพยาบาลสามแห่งในภาคอีสานซึ่งเป็น endemic areas ของโรคเลปโตสไปโรซีส นอกจากนี้ยังได้เก็บตัวอย่างจากผู้ป่วยกลุ่มควบคุมและคนปกติด้วย ผู้ป่วยเลปโตสไปโรซีสกลุ่มที่ 1 จำนวน 60 คนจากโรงพยาบาลจังหวัดขอนแก่น ซึ่งแพทย์วินิจฉัยตามอาการว่าเป็นโรคเลปโตสไปโรซีสโดยใช้เกณฑ์ขององค์การอนามัยโรค ผู้ป่วยกลุ่มนี้มีอาการป่วยเฉลี่ย 2.97 วันก่อนไปโรงพยาบาล ในวันแรกก่อนการรักษาแพทย์ได้เจาะเลือดแยกซีรั่มเพื่อตรวจหาแอนติบอดีโดยใช้ lgM dipstick ซีรัมของผู้ป่วยรายใดให้ผลบวกก็จะถูกส่งไปยืนยันด้วยวิธี MAT ต่อไป ผู้ป่วยรายที่ซีรัมในวันแรกให้ผล lgM dipstick เป็นลบจะถูกเจาะเลือดทดสอบซ้ำในวันที่ 5 , 6 หรือ 7 และถ้าปรากฏว่ารายใดให้ผลบวก lgM dipstick ก็จะทดสอบยืนยันด้วย MAT เช่นกัน นอกจากนี้แพทย์ยังได้เก็บตัวอย่างปัสสาวะจากผู้ป่วยทุกคนในวันแรกที่ไปโรงพยาบาลเพื่อตรวจหาแอนติเจนของเชื้อเลปโตสไปราด้วยวิธี MAb based-dot blot ELISA ที่ได้พัฒนาขึ้น พบว่าผู้ป่วยกลุ่มนี้ให้ผลบวก lgM dipstick คิดเป็น cumulative positivity จากการตรวจซีรัมสองครั้งร่วมกัน 53.85% ( ทราบผลรวมในวันที่ 7 ) และ MAT มี % comulative positivity ( sensitivity ) 40% ( ทราบผลภายหลังส่งซีรัมไปตรวจ 4 เดือน หรือนานกว่านั้น ) ในขณะนี้ที่ปัสสาวะซึ่งเก็บเพียงครั้งเดียวในวันแรกที่ผู้ป่วยไปถึงโรงพยาบาลมี % positivity 61.67% และใช้เวลาในการทดสอบเพียง 1-2 ชั่วโมง ผู้ป่วยกลุ่มที่ 2 เป็นผู้ป่วยจากโรงพยาบาลมหาราช จังหวัดนครราชสีมา ที่แพทย์วินิจฉัยเบื้องต้นตามอาการว่าเป็นโรคเลปโตสไปโรซีสจำนวน 8 คน มีไข้มาแล้วเฉลี่ย 6.9 วันก่อนไปโรงพยาบาล ผลการตรวจซีรัมโดย MAT พบว่า 4 จาก 8 ราย ( 50% ) ให้ผลบวก ( ทราบผลภายหลังส่งซีรัมไปตรวจ 4 เดือนหรือนานกว่านั้น และต้องซีรัมมากกว่า 1 ตัวอย่าง ) ตัวอย่างปัสสาวะที่เก้บในวันแรกจากผู้ป่วยกลุ่มนี้เมื่อตรวจหาแอนติเจนด้วยวิธี MAb based-dot-ELISA พบว่ามีผลบวกถึง 5 ราย จากผู้ป่วย 8 ราย ( 62.5% ) และเมื่อตรวจปัสสาวะผู้ป่วย 3 รายที่ให้ผลลบในวันแรกอีกครั้งหนึ่งพบว่าให้ผลบวกทั้ง 3 ราย ดังนั้นผลบวกสะสม ( % comulative positivity หรือ sensitivity ) ของการตรวจหาแอนติเจนจึงเป็น 100% ผู้ป่วยกลุ่มที่ 3 เป็นผู้ป่วยของโรงพยาบาลขอนแก่นที่แพทย์วินิจฉัยตามอาการว่าเป็นโรคเลปโตสไปโรซีส มีอาการป่วยมาแล้วเฉลี่ย 3.4 วัน ในวันแรกที่ไปโรงพยาบาลได้ถูกเจาะเลือดเพื่อทดสอบด้วย lgM dipstick เช่นเดียวกับกลุ่มที่ 1 เมื่อ lgM dipstick ให้ผลบวกก็ได้ส่งซีรัมนั้นๆ ไปยืนยันด้วยวิธี immunofluorescence antibody test ( IFA ) ซึ่งรายใดที่ให้ผลบวก IFA ก็จะถุกส่งต่อไปทดสอบหา MAT titer ส่วนรายใดที่ซีรัมของวันแรกให้ผลลบเมื่อตรวจด้วย lgM dipstick ก็จะถูกตรวจซ้ำเช่นเดียวกับกลุ่มที่ 1 ในวันที่ 5 , 6 หรือ 7 ผู้ป่วยกลุ่มนี้แพทย์ได้เก็บตัวอย่างปัสสาวะในวันแรกและวันที่ 2 , 3 , 7 และ 14 ( Days 1 , 2 , 3 , 7 และ 14 ) เพื่อตรวจหาแอนติเจน พบว่า lgM dipstick มี % cumulative positivity 69.4% , IFA จากตัวอย่างที่ให้ผลบวก lgM dipstick แล้ว มี % positivity 64% และ MAT จากตัวอย่างที่ให้ผลบวกทั้ง lgM dipstick และ IFA แล้วมี % positivity 85.7% การตรวจหาแอนติเจนในตัวอย่างปัสสาวะในวันแรกมี % positivity 75.0% และเพิ่มเป็น 88.9% , 97.2% และ 100% ในวันที่ 2 , 3 , 7 และ 14ตามลำดับ ผู้ป่วยกลุ่มที่ 4 จำนวน 22 คน จากโรงพยาบาลจังหวัดอุบลราชธานี เป็นผู้ป่วยที่ให้ผลบวกจากการเพาะเชื้อเลปโตสไปราในเลือดและ/หรือน้ำจากไขสันหลัง ( ทราบผล 6 เดือนหลังป่วย ) หรือมีผลบวก MAT ( ทราบผลภายหลังส่งซีรัมไปตรวจ 4 เดือน ) ผู้ป่วยกลุ่มนี้มีอาการป่วยมาก่อนแล้วเฉลี่ย 4.2 วัน ตัวอย่างปัสสาวะซึ่งเก็บจากผู้ป่วยในวันแรก และวันที่ 2 , 3 , 4 , 5 , 6 และ 7 และทำการตรวจหาแอนติเจนด้วยวิธี MAb based-dot-bolt ELISA พบว่ามี % positivity 81.8% , 95.5% , 100% , 100% , 100% และ 100% ตามลำดับ นอกจากนี้ยังได้ทดสอบความเฉพาะและความแม่นยำของชุดตรวจ MAb based-dot-ELISA ที่ได้พัฒนาขึ้นกับปัสสาวะจากผู้ป่วยกลุ่มควบคุมและจากคนปกติโดยตรวจหาแอนจิเจนในปัสสาวะ ซึ่งได้ผลดังนี้ ผู้ป่วยกลุ่มควบคุมจำนวน 26 คน จากโรงพยาบาลขอนแก่นซึ่งมีอาการไข้โดยไม่ทราบสาเหตุ ( P.U.O. ) แต่ต่อมาสามารถจำแนกได้ดังนี้ ผู้ป่วยมะเร็งท่อน้ำดี ( cholangio-carcinoma ; CCA ) 10 ราย ผู้ป่วยโรคเมลิออยโตซีส ( จากการวินิจฉัยตามอาการ ) 8 ราย ผู้ป่วยมาลาเรีย ( พบเชื้อในเลือด ) 3 ราย ผู้ป่วยสครับไทฟัส ( พบแอนติบอดีโดยการตรวจทางซีโรโลยี ) 1 รายและผู้ติดเชื้อพยาธิใบไม้ตับ 4 ราย ผลการตรวจปัสสาวะที่เก็บจากผู้ป่วยคนละ 1 ครั้งพบว่ามีผู้ป่วย 3 ราย ที่แพทย์วินิจฉัยตามอาการว่าเป็นเมลิออยโตซีสให้ผลบวกต่อการตรวจหาแอนติเจนของเชื้อแลปโตสไปโรซีส ซึ่งจากการนำปัสสาวะของผู้ป่วย 3 รายนี้ไปทดสอบด้วยวิธีเวอสเทอร์นบลอทพบว่ามีแถบแอนติเจน-แอนติบอดี ตรงตำแหน่ง 38 กิโลดัลตัน เมื่อตรวจด้วย MabLF9 และมีแถบแอนติเจน – แอนติบอดีตรงตำแหน่ง 35-36 กิโลดัลตัน เมื่อตรวจด้วย MabLD5 ซึ่งเป็นการยืนยันว่าผลการตรวจหาแอนติเจนของเชื้อเลปโตสไปราเป็นผลบวกจริงส่วนอีก 23 รายให้ผลลบ จากตัวอย่างปัสสาวะของคนสุขภาพปกติ 120 ราย ซึ่งเป็นชาวอีสานเช่นเดียวกับผู้ป่วยเลปโตสไปโรซีสพบว่ามีแอนติเจนของเชื้อเลปโตสไปราในปัสสาวะ 1 ราย เมื่อตรวจด้วย MAb based-dot-blot ELISA อย่างไรก็ดีเนื่องจากไม่มีตัวอย่างเหลือพอสำหรับการตรวจยืนยันด้วยวิธีเวสเทอร์นบลอทจึงไม่สามารถบอกได้ว่าเป็นผลบวกปลอมหรือผลบวกจริง กรณีนี้ผู้วิจัยจึงมีความเห็นว่าอาจเป็นเพราะกำลังติดเชื้อโดยไม่มีอาการป่วย หรือเคยป่วยแต่ได้รับประทานยาเองและหายแล้วแต่ยังมีเชื้ออยู่ก็เป็นได้ นอกจากการพัฒนาชุดตรวจ MAb based-dot-blot ELISA สำหรับตรวจหาแอนติเจนในปัสสาวะแล้ว ผู้วิจัยยังได้พัฒนาชุดตรวจหาแอนติเจนในเลือดด้วยวิธี Pab-MAb based- sandwich ELISA ด้วย และพบว่าการตรวจหาแอนติเจนในเลือดโดยใช้ซีรัมและพลาสมานั้นมีความไวต่ำ ส่วนการใช้พลาสมาและ buffy coat รวมกันให้ความไวสูง 100% ชุดตรวจหาแอนติเจนในปัสสาวะดังกล่าวข้างต้นได้ถูกนำไปใช้ตรวจกรองวัวจากฟาร์มที่เคยมีประวัติการแท้งเพราะโรคเลปโตสไปโรซีสพบว่าสามารถใช้ได้ผลดี นอกจากนี้คณะผู้วิจัยยังได้พัฒนาเทคนิคพีซีอาร์เพื่อใช้ตรวจการปนเปื้อนเชื้อเลปโตสไปราในตัวอย่างน้ำเชื้อวัว ( semen ) จากคลังน้ำเชื้อของกองผสมเทียม กรมปศุสัตว์ด้วย ซึ่งการตรวจกรองดังกล่าวจะช่วยให้หลีกเลี่ยงการใช้ contaminate semen ในการผสมเทียมเพื่อป้องกันการแท้งลูกของแม่วัว โครงการย่อยที่ 2 การพัฒนากรรมวิธีทางอิมมิวโนวิทยาสำหรับวินิจฉัยโรคติดเชื้อเอ็นเทอโรฮีโมราจิกเอชเชอริเซียโคไล ( อี โคไล ) [ กลุ่ม O157 และกลุ่มที่ผลิตสารพิษชิกา ( Shiga toxin producing E.coli ; STEC ) คณะผู้วิจัยได้พัฒนาวิธี monoclonal antibody based dot-ELISA ( dot-ELISA ) เพื่อตรวจวินิจฉัยโรคติดเชื้ออีโคไลกลุ่ม O157 และ STEC โดยการผลิตไฮบริโดมาซึ่งสร้างและหลั่งโมโนโคลนาลแอนติบอดี ( MAb ) เฉพาะต่อ O157 lipopolysaccharide ( LPS ) และสารพิษชิกาทั้งชนิดที่ 1 ( Shiga toxin 1 ) และชนิดที่ 2 ( Shiga toxin 2 ) ทั้งต่อส่วนเอ ( A subunit ) และส่วนบี ( B subunit ) ของสารพิษทั้งสองชนิดคือ MabO157 , MabStx1A , MabStx1B , MabStx2A และ MabStx2B และใช้ MAb เหล่านี้เป็น detection reagents เพื่อตรวจหาแอนติเจนในตัวอย่างอุจจาระและ/หรือ rectal swabs จากผู้ป่วยอุจจาระร่วงสี่กลุ่มเปรียบเทียบกับวิธีเพาะแยกเชื้อโดยวิธีมาตราฐาน ( conventional culture method ) ตัวอย่างใดที่ให้ผลไม่ตรงกัน ได้ตรวจยืนยันด้วยวิธีที่สามคือวิธี Verocytotoxic assay เพื่อตรวจหา Shiga toxin หรือวิธีที่สี่คือวิธี Western blot analysis เพื่อตรวจหา O157 lipopolysaccharide ( O157 LPS ) ตัวอย่างอุจจาระผู้ป่วยที่ใช้ในโครงการย่อยที่ 2 นี้แบ่งเป็น 4 กลุ่ม กลุ่มที่ 1 เป็น rectal swabs จากผู้ป่วยอุจจาระร่วงจำนวน 499 คนจากโรงพยาบาลพระจอมเกล้า จังหวัดเพชรบุรีการเพาะเลี้ยงเชื้อโดยวิธีเพาะเชื้อมาตราฐานทำที่โรงพยาบาลพระจอมเกล้าโดยนักเทคนิคการแพทย์ของโรงพยาบาล ส่วน rectal swabs ซึ่ง enriched ใน buffered peptone water ( BPW ) ส่งไปตรวจหาแอนติเจนที่ภาควิชาจุลชีววิทยาและอิมมิวโนโลยี คณะเวชศาสตร์เขตร้อน กรุงเทพฯ ผลการทดสอบนำมาเปรียบเทียบกันภายหลังจากทดสอบเสร็จทั้งหมดทุกตัวอย่างแล้วทั้งสองวิธี กลุ่มที่ 2 เป็นตัวอย่างอุจจาระของผู้ป่วยชาวญี่ปุ่นจำนวน 5 ตัวอย่าง ซึ่งเก็บโดย Dr. A. Kai, Department of Microbiology , Tokyo Metropolitan Research Laboratory of Public Health , Tokyo ประเทศญี่ปุ่น การเพาะเลี้ยงเชื้อทำโดย Dr. A. Kai การทดสอบหาแอนติเจนทำที่คณะเวชศาสตร์เขตร้อน มหาวิทยาลัยมหิดล กรุงเทพฯ โดยวิธี dot-ELISA แล้วนำผลมาเทียบกันภายหลังตรวจเสร็จแล้วทั้งสองวิธี ตัวอย่างกลุ่มที่ 3 เป็น rectal swabs ใน buffered glyceral saline ( BGS )ของผู้ป่วยอุจจาระร่วงชาวเวียตนามจำนวน 42 คน ซึ่งไปขอรับการรักษาที่ 108 Hospital , Hanoi การเพาะแยกและตรวจหาเชื้อทำที่ห้องปฏิบัติการของ 108 Hospital และการตรวจหาแอนติเจนโดย dot-ELISA ทำให้คณะเวชศาสตร์เขตร้อน มหาวิทยาลัยมหิดล กรุงเทพฯ ตัวอย่างกลุ่มที่ 4 เป็น rectal swabs ใน BPW ของผู้ป่วยอุจจาระร่วงจำนวน 82 คน ซึ่งไปขอรับการรักษาที่โรงพยาบาลบำราศนราดูร จังหวัดนนทบุรี การเพาะแยกเชื้อทำที่โรงพยาบาลบำราศนราดูร ส่วนการตรวจหาแอนติเจนโดย dot-ELISA ทำที่คณะเวชศาสตร์เขตร้อน มหาวิทยาลัยมหิดล กรุงเทพฯ เช่นเดียวกับตัวอย่างกลุ่มที่ 1 , 2 และ 3 ผลการตรวจหาแอนติเจน O157 และ Shiga toxins ในตัวอย่างอุจจาระและ rectal swabs ทั้งหมด 628 ราย พบว่ามีผลเป็นบวกเพียง 9 รายคือ ตัวอย่างอุจจาระจากชาวญี่ปุ่น 5 รายและชาวไทยจากโรงพยาบาลพระจอมเกล้า เพชรบุรี 4 ราย ผลการเพาะแยกเชื้อพบว่าจากอุจจาระของผู้ป่วยชาวญี่ปุ่น 5 ราย สามารถแยกแบคทีเรียได้ดังนี้คือ 1. รายได้ E.coli non O157 , stx1+ , stx2+ , 2 รายได้ E.coli O157 , stx1- , stx2+ , 1 รายได้ E.coli O157 , stx1+ , stx2+ , และ 1 รายเป็น E. coli O157 , stx1+ , stx2- ส่วน rectal swabs จากผู้ป่วยชาวไทย 4 ราย ที่ให้ผลบวก dot-ELISA นั้น 1 รายให้ผลบวกต่อ MabO157 อีก 3 รายให้ผลบวกต่อ MabStx2A และ MabStx2B และผลการเพาะเลี้ยงเชื้อ แยกได้ E. coli แต่ไม่สามารถ type ได้ อย่างไรก็ดี Western blot analysis ของตัวอย่างที่ให้ผลบวกต่อ MabO157 โดย dot-ELISA พบว่ามี O157 LPS อยู่จริงและ 3 ตัวอย่างที่ให้ผลบวกต่อ MabStx2A และ MabStx2B โดย dot-ELISA พบว่าให้ผลบวกเมื่อทดสอบด้วย Verocytotoxic assay ซึ่งแสดงว่ามี Shiga toxin อยู่ในตัวอย่างจริงแต่เนื่องจากปริมาณของตัวอย่างมีน้อยจึงไม่สามารถนำไปทำทดสอบเพื่อหาชนิดของ Shiga toxin โดยวิธี neutralization ว่าเป็น Stx1 หรือ Stx2 ได้ นอกจากนี้คณะผู้วิจัยยังได้สำรวจหาเชื้อ STEC และ O157 E.coli จากอุจจาระวัว ควาย ซึ่งมีรายงานจากประเทศอื่นๆ ว่าเป็นแหล่งกักตุนเชื้อ ( reservoir ) STEC โดยเก็บตัวอย่างจากวัว-ควาย ใน 5 จังหวัดคือ นครปฐม ราชบุรี ลพบุรี นนทบุรี และอุบลราชธานี พบว่าจากจำนวนอุจจาระของวัวปกติ 139 ตัว สามารถ isolate STEC ได้ 48 สายพันธุ์และ O157 E. coli 1 สายพันธุ์รวมเป็น 49 สายพันธุ์ จากการศึกษาจีโนทัยป์และฟีโนทัยป์ด้วยวิธีเพิ่มสารพันธุกรรมด้วยปฏิกิริยาลูกโว่โพลีเมอเรส ( พีซีอาร์ ) มัลติเพล็กซ์พีซีอาร์ เอริค-พีซีอาร์ ( ERIC-PCR )ศึกษาพลาสมิดและการดื้อยาปฏิชีวนะพบว่า STEC และ O157 E.coli ที่แยกได้จากอุจจาระวัว-ควาย จำนวน 22 สายพันธุ์จาก 49 สายพันธุ์เป็น non-O157 , stx1+/stx2+ , 22 จาก 49 สายพันธุ์เป็น non-O157 , stx1-/stx+ , 4 สายพันธุ์เป็น non-O157 , stx1+/stx2- , และ 1 สายพันธุ์เป็น O157+ stx1-/stx2- ซึ่งผลการทดสอบด้วย Verocytotoxic assay และ MAb O157 dot-ELISA ให้ผลตรงกลับพีซีอาร์และมัลติเพล็กซ์ พีซีอาร์ จาก 49 สายพันธุ์พบว่า 38 สายพันธุ์มี hlyA gene จากการตรวจด้วยพีซีอาร์ และ 37 จาก 38 สายพันธ์นี้ผลิต hemolysin ซึ่งทำให้เกิด ?-hemolysis ใน blood agar plate จากการตรวจซีโรกรุ๊ปของเชื้อทั้ง 49 สายพันธุ์ด้วย serogroup specific antisera พบว่าสามารถบอกซีโรกรุ๊ปได้เพียง 16 สายพันธุ์คือ 7 สายพันธุ์เป็น O8 และ 3 สายพันธุ์เป็น O15 ส่วนอีก 6 สายพันธุ์พบว่าเป็น O27 , O29 , O142 , O152 , O157 และ O168 ซีโรกรุ๊ปละ 1 สายพันธุ์ สำหรับ 33 สายพันธุ์ที่ type ไม่ได้นั้น พบว่ามี stx gene ( s )ทุกสายพันธุ์และ 30 สายพันธุ์เป็น smooth variants ส่วนอีก 3 สายพันธุ์เป็น rough mutants จากสายพันธุ์ที่ type ได้พบว่า 2 สายพันธุ์ที่เป็น O15 มี eae และ tir genes ซึ่งเป็นvirulence factors ที่สำคัญในการก่อโรค เมื่อศึกษาหา genes อื่นๆ ในพลาสมิดคือ eipD และkatP พบว่าไม่มี isolate ใดมี etpD gene และ 3 สายพันธุ์มี katP gene จากการตรวจความไวต่อยาปฏิชีวนะ ( แอมพิซิลลิน 10 ไมโครกรัม คลอแรมเฟนิคอล 30 ไมโครกรัม เซฟาโลทิน 30 ไมโครกรัมและซัลฟาเมท๊อกซาโซล-ตรัยเมโทพริม 25 ไมโครกรัม ) พบว่า 48 จาก 49 สายพันธุ์ไว ( sensitive ; S ) ต่อยาที่ทดสอบ และมีเพียง 1 สายพันธุ์ที่ดื้อ ( resistant ; R ) ยาแอมพิซิลลินคลอแรมเฟนิคอลและซัลฟาเมท็อกซาโซล-ตรัยเมโทพริม จากการจำแนก STEC และ O157 E.coli ทั้ง 49 สายพันธุ์โดยใช้ genes ในโครโมโซมและพลาสมิดและความไว ( S ) หรือความดื้อ ( R ) ต่อยาปฏิชีวนะ พบว่าสามารถจำแนกได้เป็น 9 กลุ่มและกลุ่มที่พบมากที่สุดคือ กลุ่มที่ 1 ซึ่งเป็น non-O157 , stx1+/stx2+ , eae- , tir- , etpD , hlyA+ , katP- , S นอกจากนี้ยังจำแนกแบคทีเรียทั้ง 49 สายพันธุ์ตามจำนวนและขนาดของพลาสมิดออกเป็น 10 กลุ่ม โดย 46 สายพันธุ์มีพลาสมิดต่างกันเป็น 9 กลุ่มและ 3 สายพันธุ์ไม่มีพลาสมิด จำนวนพลาสมิดที่พบมีตั้งแต่ 1-9 plasmids และมีขนาดตั้งแต่ 1-9 kb จากการใช้เทคนิค ERIC-PCR พบว่าสามารถจำแนกแบคทีเรียทั้ง 49 สายพันธุ์ ได้เป็น 11 กลุ่ม คือมี bands 3-6 bands ซึ่งมีขนาดต่างกันตั้งแต่ >100 – 3,000 bp ข้อมูลเหล่านี้แสดงให้เห็นว่า STEC และ O157 E.coli ที่พบในวัว-ควายสุขภาพปกติในประเทศไทยมีจีโนทัยป์และฟีโนทัยป์ที่หลากหลาย และแม้ว่าจะยังไม่พบว่าแบคทีเรียสายพันธุ์ใดมี virulence genes ที่ครบถ้วนสำหรับก่อโรคในมนุษย์แต่การที่มีแบคทีเรียที่มี virulence genes ต่างๆ กันอยู่ในอุจจาระวัว-ควายตัวเดียวกัน อาจเอื้อให้เกิดการถ่ายทอดยีนระหว่างแบคทีเรียและทำให้เชื้อมีวิวัฒนาการเป้นเชื้อก่อโรคในคนได้ โครงการย่อยที่ 3 การเตรียมส่วนประกอบของวัคซีนป้องกันโรคอหิวาต์ชนิดกนและการทดสอบประสิทธิภาพของแอ็ดจูแวนท์ชนิดใหม่ ผู้วิจัยได้ผลิต recombinant E.coli clones ซึ่ง carry genes ในการสร้าง toxin coregulated pili ( tcpA ) และ genes ที่ควบคุมการสร้างสารพิษ ( ctxA/ctxB ) ของเชื้ออหวาต์และได้เตรียม purified TcpA และ CT จาก recombinant clones เพื่อใช้เป็น vaccine components โดยก่อนใช้ได้นำ CT ไปบ่มด้วยความร้อนจนความเป็นพิษของส่วนเอเกือบหมดแต่ส่วนบียังคงอยู่และจับกันเป็นโมเลกุลขนาดใหญ่ ( polymers ) เพื่อเพิ่ม immunogenicity และเรียกโมเลกุลของ CT ที่เปลี่ยนแปลงไปว่า procholeragenoid หรือ P จากนั้นเตรียม vaccine component อีกชนิดหนึ่งคือ V.cholerae lipopolysaccharide ( LPS ) แล้วนำ LPS , TcpA และ P ไปเตรียมวัคซีนสูตรต่างๆ 6 formulations ด้วยกันคือ vaccine 1 ประกอบด้วย LPS , TcpA และ P [ รวมเรียกว่า antigen ( Ag ) ] ใส่ในลิโพโซม ( liposome : L ) และผสม bacterial CpG ( vaccine 1 = Ag + L + CpG DNA , vaccine 3 ประกอบด้วย L+Ag , vaccine 4 ประกอบด้วย CpG DNA + Ag , vaccine 5 ประกอบด้วย non CpG DNA + Ag และ vaccine 6 ประกอบด้วย Ag ( LPS , TcpA และ P ) เท่านั้น นำวัคซีนทั้ง 6 formulations ไปทดสอบในหฯ Wistar rats 6 กลุ่ม โดยให้หฯแต่ละกลุ่มกินวัคซีนแต่ละชนิดตัวละ 3 โดส โดยเว้นระยะห่างกันระหว่างโดส 14 วัน นอกจากนี้ยังมีหนูกลุ่มควบคุมอีก 3 กลุ่ม ซึ่งได้รับวัคซีนหลอก ( placebos ) คือ CpG-DNA , L. และ vaccine diluent ( 3 ml 5% NaHCO3 ) ตามลำดับ หลังจากได้รับวัคซีนหรือ placebos โดสสุดท้ายแล้ว 7 วันได้เจาะเลือดหนู rats ทุกตัวเพื่อหาระดับซัยโตไคน์ รวมทั้งได้ตรวจนับจำนวนเซลล์ที่ผลิตแอนติบอดีต่อแอนติเจนทั้งสามชนิดในลำไส้ส่วนเจจูนัมด้วยวิธีแซนด์วิชอิมมูโนฟลูออเรสเซนท์ พบว่าวัคซีนทั้ง 6 สูตรมี immunogenicity จากสูงไปต่ำเมื่อเทียบกันเองและเทียบกับกลุ่ม placebos ดังนี้ vaccine 1 > vaccine 2 = vaccine 3 > vaccine 4 > vaccine 5 = vaccine 6 > placebo 1 = placebo 2 = placebo 3 ส่วนการตรวจหาซัยโตไคน์คือ IL-4 และ IL-10 ในเลือดซึ่งเก็บในวันที่ 7 หลังจากหนูทดลองได้รับวัคซีนหรือ placebo โดสสุดท้ายไม่พบว่ามีการเปลี่ยนแปลงใดๆ เมื่อเทียบกับหนูปกติที่ไม่ได้รับวัคซีนและไม่มีความแตกต่างกันระหว่างกลุ่มซึ่งอาจเป็นไปได้ว่าการเจาะเลือดในวันที่ 7 หลังจากได้รับวัคซีนและ plascebos โดสสุดท้ายนั้นค่อนข้างล่าช้าเกินไปและระดับซัยโตไคน์ต่างๆ ได้ลดระดับลงแล้วหรือเป็นไปได้ว่าการเปลี่ยนแปลงระดับของซัยโตไคน์มีอยู่เพียงในลำไส้และตรวจไม่พบในกระแสเลือด เนื่องจากเป็นที่ทราบว่าซัยโตไคน์ส่วนใหญ่ออกฤทธิ์แบบ paracrine เป็นระยะเวลาสั้นๆ ดังนั้นการวัดระดับซัยโตไคน์ในเลือดจึงไม่เห็นการเปลี่ยนแปลงใดๆ อย่างไรก็ดีสามารถสรุปได้ว่า คณะผู้วิจัยได้ผลิต recombinant vaccine components สำเร็จแล้วตามที่เสนอและได้ทดสอบประสิทธิภาพของ CpG-DNA ซึ่งเป็นแอ็ดจูแว้นท์ชนิดใหม่ในการเพิ่ม immunogenicity ของวัคซีนป้องกัน อหิวาต์ชนิดกินแล้วและพบว่า CpG-DNA ได้ทำให้ immunogenicity ของวัคซีนเพิ่มขึ้น Subproject I Development of a Ready- to- Use Diagnostic Test Kit for Leptospirosis Hybridomas secreting specific monoclonal antibodies (MAb) to all members of the genus Leptospira (clone LF9) and those that are specific only to the pathogenic species (clones LD5 and LE1) were produced. MAb LF9, which was immunoglobulin G1 (IgG1), reacted to a 38-kDa component of the sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis-separated whole-cell homogenates of all Leptospira spp., while MAb LD5 and MAb LE1, which were IgG1 and IgG2a, respectively, reacted to the 35- to 36-kDa components of homogenates of all serogroups of the pathogenic species of Leptospira. The MAb LD5 was used in a dot blot-enzyme-linked immunosorbent assay (dot-ELISA) for detecting Leptospira antigen in urine samples either singly collected or serially collected from four groups of patients diagnosed with leptospirosis, i.e., group 1: 60 patients clinically diagnosed leptospirosis using WHO criteria. They had had fever for the average of 2.97 days before hospitalization. Single urine samples were collected from individual patients upon hospital arrival and before any treatment; group 2 included 8 clinically diagnosed patients. Urine samples were collected from them three times, i.e. days 1, 7-19 and 22-38; group 3 were 36 clinically diagnosed leptospirosis patients. Urine samples were collected on days 1, 2, 3, 7 and 14 of hospitalization and group 4 were 22 patients whose samples were either culture positive for Leptospira spp. or MAT positive. Urine samples were collected from them on days 1-7. The serum samples of patients were tested serologically by IgM dipstick assay, indirect immunofluorescence assay (IFA), and/or microscopic agglutination test (MAT). Urine samples of 26 patients diagnosed with other illnesses and 120 healthy individuals serve as controls. For the first group of patients, their blood samples taken at the first day of hospital arrival and 5, 6 or 7 days later revealed cumulative positivity at 53.85% by IgM dipstick and 40% by MAT (the results were obtained about 4 months after sending the sera). Their single urine samples collected on the first day of hospitalization gave 61.67% positivity by MAb based-dot-ELISA and the test time was only 1-2 hours. For the second group of patients, who had been ill for an average of 6.9 days before hospitalization, the MAT were positive for 4 of 8 (50%) patients, while the Leptospira antigenuria tested by the MAb based-dot-ELISA was positive for 62.5%, 100% and 100% of the urine samples collected on days 1, 7-19 and 22-38, respectively. For the third group of patients who were 36 clinically diagnosed leptospirosis and who had been ill for an average of 3.4 days before hospitalization, the IgM dipstick (tested twice), IFA and MAT were positive for 83.3%, 70% and 85.7% of patients, while the Leptospira antigenuria tested by the MAb based-dot- ELISA was positive for 75%, 88.9%, 97.2%, 97.2% and 100% on days 1, 2, 3, 7 and 14 of hospitalization, respectively. All but 1 of 11 patients whose serum samples collected on the first day of hospitalization were IgM seronegative, were positive by urine antigen test on day 1. This is a strong evidence that detection of antigen in urine can provide diagnostic information that could be useful in directing early therapeutic intervention. For the fourth group of patients who had been ill for an average of 4.2 days before hospitalization, the cumulative positivity of MAT (tested twice on two serum samples and the results were obtained after 4 months) was 72.7% and the Leptospira antigen was found in 77.3%, 81.8%, 95.5%, 100, 100, 100, and 100% of the patients’ urine samples collected on days 1, 2, 3, 4, 5, 6, and 7 of hospitalization, respectively. Leptospira antigenuria was found in 3 of the 26 patients diagnosed with other illnesses (3 clinically diagnosed melioidosis) and 1 of the 120 healthy controls. Western blot analysis revealed that the samples really contained Leptospira specific antigens. The detection of antigen in urine by the monoclonal antibody-based dot-ELISA has high potential for rapid, sensitive, and specific diagnosis of leptospirosis at a low cost. Besides urine antigen detection, we have developed an antigenemia detection assay in the form of PAb-MAb sandwich ELISA. The test revealed 100% specificity and sensitivity when buffy coat + plasma of patients who were MAT and IFA positive for leptospirosis were tested. The urine antigen detection assay was also applied to study leptospirosis in cattle. The experiments and their results are the following: Forty-five serum samples of leptospirosis suspected cattle [(serum MAT titer ≥ 1:50 as tested by the National Institute of Animal Health (NIAH)] were re-tested by MAT using a larger panel of live Leptospira serovars. On the day of serum collection, urine samples from these cattle were also collected for Leptospira culture, dark-field microscopy plus Fontana’s Silver staining and Leptospira antigen detection by dot- ELISA. Serum and urine samples from twenty healthy cattle were used as negative controls. Thirty of 45 (66.67%) serum samples of leptospirosis suspected cattle were positive by the re-tested MAT. Among them, 40% had antibodies to serovar hardjo, 26.67% of them had antibodies to serovar ranarum and sejroe, while antibodies to serovars ballum, hyos and wolffi were found in 16.67%, 13.33% and 13.33%, respectively. Fifty percent of the MAT positive serum samples revealed antibodies to more than one Leptospira serovar. All serum samples of the 20 healthy cattle were negative by MAT. Dark-field microscopy for direct visualization of Leptospira in the freshly collected urine samples after centrifugation and Fontana’s Silver staining revealed that 12 of 45 (26.7%) contained Leptospira spp. Among these 12 samples, Leptospira could be cultured from 6 of the different aliquots of same urine samples. Dot-ELISA for Leptospira antigen detection was positive for 21 of 45 (46.67%) urine samples Thus, the diagnostic sensitivity, diagnostic specificity, accuracy, and positive and negative predictive values of the dot-ELISA in comparison with the DFM were 100.0%, 72.72%, 80.00%, 57.14% and 100.0%, respectively; and when compared with the culture method, the figures were 100.0%, 61.54%, 66.68%, 88.51% and 100.0%, respectively. There were 9 urine samples which were dot-ELISA positive but DFM negative. Similarly, there were 15 samples which were dot-ELISA positive but culture negative. All urine samples showing uncomformed results by dot-ELISA and DFM or culture were subjected to PCR using a pair of oligo-nucleotide primers designed from Leptospira 16S RNA, in order to detect the DNA of the organisms. It was found that all of the 21 dot-ELISA positive urine samples revealed Leptospira DNA amplicon (331 bp) by PCR which confirmed that the results of dot-ELISA antigen detection results were correct. Moreover, Leptospira DNA was detected by the PCR in one of the dot-ELISA negative, DFM negative and culture negative urine sample. The urine sample was MAbLF9 based dot-ELISA positive for non-pathogenic Leptospira spp. antigen, indicating that the PCR detects both pathogenic and non-pathogenic Leptospira DNA while dot-ELISA detects only pathogenic Leptospira antigen. The diagnostic sensitivity, diagnostic specificity, accuracy, and positive and negative predictive values of the dot- ELISA in comparison with the PCR were 95.45%, 100.0%, 97.77%, 100.0% and 95.83%, respectively. The DNA amplification by PCR could detect Leptospira DNA in semen specimens (30%) in this study. It is, therefore, useful for the screening of a semen in semen bank for work on artificial insemination of cattle. Dot-ELISA was not reactive when tested on urine samples of 20 healthy cattle which indicates 100% specificity of the assay. Dot-ELISA detects only pathogenic Leptospira antigen at the diagnostic accuracy equal to PCR. The dot-ELISA is rapid, easy to perform and relatively and arbitrarily inexpensive. It appears to be a very useful test for diagnosis of leptospirosis in cattle where this disease predominates. The dot-ELISA has been formulated into a test kit called “Lepto-Dot” for detection of antigenuria while the sandwich ELISA has been formulated into “A plate sandwich ELISA” for antigenemia detection. Both test kits are now ready for marketing. Subproject II Development of Diagnostic Method for Enterohemorrhagic Escherichia coli (Shiga toxin producing-E. coli) Infection Hybridomas secreting monoclonal antibody (MAb) to lipopolysaccharide (LPS) of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) serogroup O157 and Shiga toxins 1 and 2 and their A and B subunits were produced. The mono-epitope specificities of the MAb were screened using the homologous antigen and a wide range of heterologous antigens. The MAb to O157 LPS and MAbs to A-and B-subunits of Stx-1 and Stx-2 were used in a dot-ELISA for the detection of their respective antigens in stool rectal swab samples collected from patients with diarrhea. The MAb-based dot-ELISA, when performed in double-blinded manner, was positive for 9 samples (5 Japanese and 4 Thai samples) of 628 patients with diarrheas. Bacterial isolations from the dot-ELISA positive samples revealed 1 sample with non-O157, stx-1+, stx-2+ E. coli, 2 samples with O157, stx-1-, stx-2+ E. coli, 1 sample with O157, stx-1+, stx-2+ E. coli, 1 sample with O157, stx-1+, stx-2- E. coli, and 4 samples with untypeable E. coli. The results of the 5 Japanese samples tested by the culture and isolation method and the dot-ELISA were conformed. However, the 4 stool samples of the Thai patients were found to harbour E. coli but the serotyping was not performed. The MAbO157 dot-ELISA positive sample was subjected to Western blot analysis and O157 lipopolysaccharide was revealed. The 3 samples which were Stx2 positive by dot-ELISA were subjected to Verocytotoxic assay which the positive results were obtained indicating the presence of Stx. The dot- ELISA was negative for other samples. Shiga toxin producing-Escherichia coli (STEC) has not yet been identified as an important etiologic agent of human disease in Thailand. To evaluate the potential for STEC to contribute to human disease in Thailand, 139 fecal samples were collected from healthy cattle from 5 different provinces and the isolated bacteria were analyzed by genotypic and phenotypic methods for STEC. Of 139 samples, 27 (19.4%) were positive for stx1 and/or stx2 by multiplex polymerase chain reaction, or for O157 lipopolysaccharide (LPS) by immunoassay. Isolates positive for stx and/or O157 were subdivided into 49 strains that varied in the presence of the virulence determinants: stx1+/stx2+ (22 strains), stx2+ (22 strains), stx1+ (4 strains), and O157 LPS (1 strain). Within these 49 distinguishable strains, other virulence determinants varied as follows: hlyA+ (77.6%), eae+ and tir+ (4.1%), and katP+ (6.12%). The most predominant profile (22 isolates) was stx1+/stx2+, eae-, tir-, etpD-, hlyA+, katP-. For further characterization of the isolated strains 2 molecular typing assays, plasmid profiles and ERIC PCR, were performed. The results suggest that the genetic and phenotypec profiles of STEC associated with human disease are not prevalent at this time in cattle in Thailand. The antigen detection assay, i.e. dot-ELISA is easy to perform and relatively inexpensive compared to the culture, verocytotoxic assay and DNA amplification (PCR) methods. The procedure requires only 90 min; thus, the results are useful for treatment indication. The dot-ELISA provides multi-sample testing at a single time without significant increase in the turn around time. It does not require additional equipment and does not produce large quantities of contaminated waste. Most of all, the test using a cocktail of MAbs to the A-and B-subunits of both Stx offers detection of the respective antigens in clinical specimens of patients infected with non-O157 Shiga toxin-producing bacteria. Subproject III Preparation of oral cholera vaccine component and efficacy testing of a new vaccine adjuvant Recombinant V. cholerae toxin co-regulated pili (TcpA) and cholera toxin (CT) clones were produced. An oral cholera vaccine made up of three Vibrio cholerae antigens, i.e. recombinant toxin co-regulated pili (rTcpA), procholeragenoid (P) which is a heat treated-high molecular weight CT, and lipopolysaccharide (LPS) has been formulated into six different formulations. Eight-week-old Wistar rats were divided into nine groups. The first group received the oral vaccine 1 consisting of the three antigens (rTcpA, P and LPS) associated with a liposome (L) and bacterial CpG-DNA (ODN#1826), whereas the rats of groups 2 and 3 received oral vaccines 2 and 3 consisting of the liposome-associated three antigens with and without non-bacterial CpG-DNA (ODN#1982), respectively. Rats of groups 4 received oral vaccine 4 consisting of the three antigens mixed with the ODN#1826 whereas rats of groups 5 and 6 received oral vaccines 5 and 6 consisting of the three antigens with and without ODN#1982, respectively. Rats of groups 7, 8 and 9 received oral placebos, namely ODN#1826 (CpG), liposomes (L), and vaccine diluent, i.e. 5% NaHCO3 solution, respectively. All vaccines were given orally in three doses at 14-day intervals. It was found that liposomes and ODN#1826 in vaccine 1 displayed better adjuvant properties in terms of evoking the highest immune response to V. cholerae antigens compared to other vaccine formulations and placebos, as measured by the appearance of antigenspecific antibody-producing cells in the intestinal lamina propria. The immunogenicity in the order of magnitude of immune response: V1>V2=V3>V4>V5=V6>V7=V8=V9. The results of this study indicate that CpG-DNA and liposome may be effective as a mucosal adjuvant and a delivery vehicle, respectively, for an oral vaccine. Similar vaccine formulations should be tested in humans.

บรรณานุกรม :
วันเพ็ญ ชัยคำภา . (2548). วิทยาภูมิคุ้มกันเพื่อวินิจฉัยโรคติดเชื้อ และ การพัฒนาวัคซีนป้องกันโรคอหิวาต์ชนิดกิน.
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย.
วันเพ็ญ ชัยคำภา . 2548. "วิทยาภูมิคุ้มกันเพื่อวินิจฉัยโรคติดเชื้อ และ การพัฒนาวัคซีนป้องกันโรคอหิวาต์ชนิดกิน".
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย.
วันเพ็ญ ชัยคำภา . "วิทยาภูมิคุ้มกันเพื่อวินิจฉัยโรคติดเชื้อ และ การพัฒนาวัคซีนป้องกันโรคอหิวาต์ชนิดกิน."
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย, 2548. Print.
วันเพ็ญ ชัยคำภา . วิทยาภูมิคุ้มกันเพื่อวินิจฉัยโรคติดเชื้อ และ การพัฒนาวัคซีนป้องกันโรคอหิวาต์ชนิดกิน. กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย; 2548.