ridm@nrct.go.th   ระบบคลังข้อมูลงานวิจัยไทย   รายการโปรดที่คุณเลือกไว้

การโคลนและศึกษาหน้าที่ของ gonad-inhibiting hormone ในกุ้งกุลาดำ

หน่วยงาน สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย

รายละเอียด

ชื่อเรื่อง : การโคลนและศึกษาหน้าที่ของ gonad-inhibiting hormone ในกุ้งกุลาดำ
นักวิจัย : อภินันท์ อุดมกิจ
คำค้น : black tiger shrimp , ovarian maturation , RNA interference , vitellogenin , การเจริญของรังไข่ , กุ้งกุลาดำ , ไวเทลโลจีนิน
หน่วยงาน : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย
ผู้ร่วมงาน : -
ปีพิมพ์ : 2550
อ้างอิง : http://elibrary.trf.or.th/project_content.asp?PJID=RSA4680008 , http://research.trf.or.th/node/1645
ที่มา : -
ความเชี่ยวชาญ : -
ความสัมพันธ์ : -
ขอบเขตของเนื้อหา : -
บทคัดย่อ/คำอธิบาย :

Gonad-inhibiting hormone หรือ GIH เป็นฮอร์โมนสำคัญที่ทำหน้าที่ยับยั้งการพัฒนาของไข่ในกุ้งเพศเมีย แหล่งผลิต GIH ได้แก่ปมประสาทในบริเวณก้านตาที่เรียกว่า X-organ ซึ่งผลิตฮอร์โมนที่สำคัญหลายชนิดเช่น crustacean hyperglycemic hormone (CHH) และ molt-inhibiting hormone (MIH) GIH ยับยั้งการพัฒนาของไข่โดยการยับยั้งการสร้างไวเทลโลจีนิน ซึ่งจะถูกเปลี่ยนไปเป็นไวเทลลิน และสะสมในไข่ที่กำลังเจริญ ด้วยเหตุนี้จึงใช้วิธีตัดตาเพื่อเร่งให้แม่กุ้งวางไข่ในการผลิกลูกกุ้งในฟาร์มเพาะเลี้ยง ซึ่งทำให้มีการใช้กุ้งแม่พันธุ์จำนวนมากในแต่ละปี ปัจจุบันยังไม่ทราบกลไกที่แน่ชัดในกระบวนการสร้างไวเทลโลจีนินและการเปลี่ยนไวเทลโลจีนินเป็นไวเทลลิน รวมทั้งยังมีข้อมูลเกี่ยวกับ GIH ไม่มากนัก โครงการนี้จึงมีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาโครงสร้างและหน้าที่ของ GIH ในกุ้งกุลาดำ เพื่อเป็นแนวทางในการเร่งให้แม่กุ้งวางไข่โดยไม่ต้องตัดตา โดยได้ทำการโคลนชิ้น cDNA จากก้านตากุ้งแม่พันธุ์ ด้วยวิธี 3’ Rapid Amplification of cDNA Ends (3’ RACE) โดยใช้ไพรเมอร์ที่ออกแบบจาลำดับกรดอะมิโนอนุรักษ์ของฮอร์โมนในกลุมนี้จากสิ่งมีชีวิตชนิดอื่นๆ จากการวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์พบโคลนที่มีลำดับนิวคลีโอไทด์ของชิ้น cDNA insert คล้ายคลึงกับ GIH จำนวน 8 โคลนจากทั้งหมด 213 โคลน โดยทั้ง 8 โคลนมีลำดับนิวคลีโอไทด์เหมือนกัน และใช้ในการออกแบบไพร์เมอร์เพื่อโคลน cDNA ชิ้นเต็ม ซึ่งมีความยาว 861 คู่เบส และมี open reading frame ขนาด 288 คู่เบส ที่ถอดรหัสได้เป็นโปรตีนที่ประกอบด้วยส่วนที่เป็น signal peptide ความยาว 17 กรดอะมิโน และส่วนที่เป็น mature peptide ประกอบด้วยกรดอะมิโนจำนวน 79 หน่วย จากการศึกษาการแสดงออกของ GIH ในอวัยวะต่างๆของกุ้ง พบว่า GIH มีการแสดงออกในก้านตา และในปมประสาทบริเวณอื่นๆ ได้แก่ brain, thoracic ganglia และ abdominal nerve-cord การศึกษาหน้าที่ของ cDNA ที่สร้าง GIH ในการยับยั้งการสร้างไวเทลโลจีนิน ทำโดยใช้เทคนิค RNA interference (RNAi) เพื่อยับยั้งการแสดงออกของ GIH และดูผลต่อการสร้างเทลโลจีนินในภาวะที่ไม่มีการสดงออกหรือมีการแสดงออกที่ลดลงของ GIH โดยสร้างอาร์เอ็นเอสายคู่ (dsRNA) จากลำดับนิวคลีโอไทด์ส่วนที่สร้าง mature GIH และพบว่า GIH dsRNA นี้ สามารถยับยั้งการแสดงออกของ GIH ใน abdominal nerve-cord ที่เลี้ยงในอาหารเพาะเลี้ยงได้ จากนั้นได้ฉีด GIH dsRNA เข้าไปในกุ้งกุลาดำที่มีขนาดประมาณ 10-15 กรัม ในปริมาณ 5 ไมโครกรัมของ dsRNA ต่อน้ำหนักตัวของกุ้ง 10 กรัม พบว่าสามารถลดระดับการแสดงออกของ GIH ได้ประมาณ 75 % และกุ้งที่มีการแสดงออกของ GIH ลดลงนี้ จะพบการแสดงออกของไวเทลโลจีนินใน hepatopancreas เพิ่มขึ้นประมาณสองเท่า ซึ่งบ่งชี้ว่า GIH มีความเกี่ยวข้องในกระบวนการยับยั้งการสร้างไวเทลโลจีนินซึ่งมีผลต่อการเจริญของไข่ เมื่อทดลองฉีด GIH dsRNA เข้าไปในกุ้งแม่พันธุ์ แล้วติดตามดูการเจริญของรังไข่ พบว่ากุ้งในกลุ่มควบคุมที่ตัดตามีการเจริญของรังไข่และสามารถวางไข่ได้ จำนวน 4 ตัวจากกุ้งทั้งหมด 9 ตัวในกลุ่ม กุ้งในกลุ่มควบคุมอีกกลุ่มหนึ่งที่ฉีดด้วย buffer อย่างเดียวสามารถวางไข่ได้เพียง 1 ตัวจาก 9 ตัว ส่วนกุ้งในกลุ่มทดลองที่ฉีดด้วย GIH dsRNA มีการเจริญของรังไข่และสามารถวางไข่ได้ 2 ตัวจากกุ้งทั้งหมด 11 ตัวในกลุ่ม ซึ่งมีแนวโน้มที่เห็นว่าการฉีด GIH dsRNA อาจช่วยให้แม่กุ้งวางไข่ได้ดีขึ้น อย่างไรก็ตามการทดลองในส่วนนี้ จะต้องทำการทดลองซ้ำอีกครั้งหนึ่ง เพื่อให้เห็นผลที่ชัดเจนขึ้น นอกจากนี้ยังได้ผลิตโปรตีนลูกผสมของ GIH ใน E. coli เพื่อจะนำมาทดสอบหน้าที่ในการยับยั้งการสร้างไวเทลลโลจีนิน และสร้าง GIH แอนติบอดี้ เพื่อนำมาทดลองใช้เร่งการวางไข่ในแม่กุ้งอีกวิธีหนึ่ง The X-organ in the eyestalk optic ganglia of crustacean produces several peptide hormones that play vital roles in growth and reproduction. Member of these hormones include crustacean hyperglycemic hormone (CHH), molt-inhibiting hormone (MIH) and gonad-inhibiting hormone (GIH). GIH play role in reproduction by inhibiting vitellogenesis, the process that synthesize a yolk protein precursor vitellogenin, in the hepatopancreas. For this reason, female shrimp broodstock are usually induced to ovarian maturation and spawning by eyestalk ablation in the process of shrimp fry production. This leads to the overexploitation of shrimp broodstock because eyestalk ablation normally causes deleterious effect to the shrimp. To date, not much is known about the mechanism that controls vitellogenesis. Moreover, the knowledge about GIH is also limited. This project is therefore aims at studying in both molecular and functional aspects of GIH in Penaeus monodon, one of the major cultured shrimp species in Thailand. A cDNA encoding P. monodon’s GIH was cloned by 3’RACE strategy using degenerate primers from the conserved amino acid sequence of GIH among GIH of other species. Eight out of 213 cloned analyzed showed similarity in their deduced amino acid sequences to GIH of Metapenaeus ensis. Nucleotide sequence comparison indicated that these eight clones represented a single transcript. Several pairs of specific primers were then designed from this 3’ RACE fragment and used in 5’RACE and RT-PCR to obtain a full-length transcript of GIH. The full-length GIH cDNA contains 861 bp with one long open reading frame of 288 bp. The open reading frame encodes 17 amino acid residues of putative signal peptide and a 79 residues mature GIH. The expression study showed that GIH expression is restricted to the nervous tissues such as eyestalk ganglia, brain, thoracic ganglia and abdominal nerve cord. Functional study of GIH cDNA was performed using RNA interference technique. A double-stranded RNA (dsRNA) was synthesized based on the nucleotide sequence of the mature region of GIH. The experiment in nerve cord explants showed that the GIH dsRNA was able to knockdown GIH transcript in the nerve cord. Next the GIH dsRNA was injected into the shrimp (approximately 10-15 g) in the ratio of 5 ?g dsRNA per 10 gram of shrimp weight. The expression of GIH in the shrimp injected with GIH dsRNA was reduced by 75% comparing to the control shrimp that did not receive dsRNA. When vitellogenin transcript was determined in the hepatopancreas of the shrimp administered with GIH dsRNA, it showed a two-fold increase in the transcription level comparing with that in the control shrimp. This resulted suggested a negative involvement of GIH in vitellogeneis that is an index of ovarian maturation. Recently, the GIH dsRNA was injected into female broodstock in order to investigate the effect of GIH knockdown on ovarian maturation. Four out of nine of the control shrimp that were unilateral eyestalk ablated underwent ovarian maturation and successful spawning whereas only one out of nine in the negative control group that was injected with buffer spawned successfully. However, injection of GIH dsRNA induced successful spawning in two out of eleven shrimp in the experimental group. This result, although needs further confirmation, suggested that GIH dsRNA injection may help induce spawning in the broodstock regardless of eyestalk ablation. Moreover, recombinant protein of GIH was produced in Escherichia coli and its function will be investigated by inhibition assay of vitellogenin synthesis in the hepatopancreas. The antibody will also be raised against this recombinant GIH and , finally, will be tested for its potential in inducing ovarian maturation in female broodstock.

บรรณานุกรม :
อภินันท์ อุดมกิจ . (2550). การโคลนและศึกษาหน้าที่ของ gonad-inhibiting hormone ในกุ้งกุลาดำ.
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย.
อภินันท์ อุดมกิจ . 2550. "การโคลนและศึกษาหน้าที่ของ gonad-inhibiting hormone ในกุ้งกุลาดำ".
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย.
อภินันท์ อุดมกิจ . "การโคลนและศึกษาหน้าที่ของ gonad-inhibiting hormone ในกุ้งกุลาดำ."
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย, 2550. Print.
อภินันท์ อุดมกิจ . การโคลนและศึกษาหน้าที่ของ gonad-inhibiting hormone ในกุ้งกุลาดำ. กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย; 2550.