ridm@nrct.go.th   ระบบคลังข้อมูลงานวิจัยไทย   รายการโปรดที่คุณเลือกไว้

กระบวนการทางชีวเคมีที่เกี่ยวข้องกับการอุดตันของท่อยางในต้นยางพารา

หน่วยงาน สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย

รายละเอียด

ชื่อเรื่อง : กระบวนการทางชีวเคมีที่เกี่ยวข้องกับการอุดตันของท่อยางในต้นยางพารา
นักวิจัย : รพีพรรณ วิทิตสุวรรณกุล
คำค้น : -
หน่วยงาน : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย
ผู้ร่วมงาน : -
ปีพิมพ์ : 2541
อ้างอิง : http://elibrary.trf.or.th/project_content.asp?PJID=RSA3780033 , http://research.trf.or.th/node/1527
ที่มา : -
ความเชี่ยวชาญ : -
ความสัมพันธ์ : -
ขอบเขตของเนื้อหา : -
บทคัดย่อ/คำอธิบาย :

น้ำยางเป็นของเหลวสีขาวที่ถูกสร้างและบรรจุอยู่ภายในท่อน้ำยาง นอกจากส่วนของของ เหลวใส (C-serum) ซึ่งเป็นส่วนประกอบหลักแล้ว น้ำยางจะประกอบไปด้วยอนุภาคแขวนลอย ต่างๆจากปริมาณมากไปหาน้อย คือ อนุภาคยาง, อนุภาคลูทอยด์ (lutoid) และ แฟรวิสลิ่งคอมเพ ลกซ์ การกรีดโดยเฉือนผ่านท่อน้ำยางจะทำให้น้ำยางไหลออกมา ต้นยางจะมีวิธีการยับยั้งการสูญ เสียน้ำยางดังกล่าว โดยการก่อให้เกิดการอุดตันบริเวณปลายท่อที่ถูกเฉือน การศึกษาด้วยกล้อง จุลทรรศน์อีเลคตรอนพบว่า บริเวณอุดตันปลายท่อน้ำยางดังกล่าวจะมีก้อนอุดตันที่ประกอบไปด้วย อนุภาคยางและซากอนุภาคลูทอยด์ที่แตกแล้วเกาะจับกันเป็นกลุ่มก้อน เพื่อยับยั้งการไหลของน้ำ ยาง ผลการวิจัยนี้ ชี้ให้เห็นว่ากระบวนการทางชีวเคมีที่เกี่ยวข้องกับการอุดตันของท่อน้ำยางในต้น ยางพารา น่าจะเกิดขึ้นได้จากการประสานงานระหว่างการทำงานของกระบวนการหลัก 2 กระบวน คือกระบวนการที่เกิดขึ้นเนื่องจากการทำงานของเอนไซม์ ที่เกี่ยวข้องกับการแตกของอนุภาค ลูทอยด์ และกระบวนการที่ไม่ต้องอาศัยการทำงานของเอนไซม์ ซึ่งเกี่ยวโยงกับการเหนี่ยวนำให้ เกิดการเกาะกลุ่มระหว่างซากของลูทอยด์ที่แตกแลัวกับอนุภาคยาง การกรีดเพื่อเปิดท่อน้ำยางเพื่อให้น้ำยางไหลออกนั้น จะทำให้บริเวณปลายท่อดังกล่าว สัมผัสกับบรรยากาศภายนอก O2ที่ได้รับจากอากาศจะส่งผลกระตุ้นต่อการทำงานของเอนไซม์ออก ซิเดสหลายตัวที่ยังผลให้เกิดการสร้าง active oxygen species ซึ่งได้แก่ superoxide (O2._) , hydroxyl radical (OH.) และ H2O2 โดย active oxygen species เหล่านี้ จะร่วมกันทำลายเสถียร ภาพของเมมเบรนของลูทอยด์ โดยเริ่มจาก เอนไซม์ NAD(P)H ออกซิเดส หรือ NAD(P)H คิวโนน รีดัสเตส ที่เมมเบรนของลูทอยด์ จะรีดิวซ์สัปสเตรท คิวโนน ไปเป็น ไฮโดรคิวโนน และ เซมิ-ควิ โนน ซึ่ง เซมิ-คิวโนน นี้ สามารถใช้ O2 ออกซิไดส์ตัวเองกลับไปเป็น คิวโนน โดยจะให้ O2._ และ หากในขณะนั้นมี H2O2 อยู่ด้วย O2._ ก็จะทำปฎิกิริยากับ H2O2 เกิด OH. ขึ้น (ปฏิกิริยา Fenton & Haber-Weiss) ซึ่งมีฤทธิ์ในการทำลายโครงสร้างไขมันไม่อิ่มตัวที่เมมเบรนของลูทอยด์ ส่งผลให้ลูทอยด์แตก ในขณะเดียวกันเอนไซม์เปอร์ออกซิเดส และโพลี่ฟีนอลออกซิเดส ที่อยู่ใน ส่วนของของเหลว ซี-ซีรั่ม ในน้ำยางก็จะอาศัยการใช้ H2O2 และ O2 ตามลำดับ ในการออกซิไดส์ สัปสเตรท ไฮโดรคิวโนน ให้กลับไปเป็นคิวโนน ทำให้เพิ่มโอกาสในการเกิด เซมิ-ควิโนน และ active oxygen species ได้มากขึ้นอีก แต่หากในขณะนั้นมี สัปสเตรทตัวอื่นๆ เช่น ฟีนอลที่อยู่ใน ซี-ซีรั่ม มาแข่งขันกับสัปสเตรทคิวโนน ก็อาจทำให้ประสิทธิภาพในการเพิ่มคิวโนน จากเซมิ-คิว โนน ลดลง การทำงานของเปอร์ออกซิเดสและโพลี่ฟีนอลออกซิเดส ไม่ว่าจะใช้สัปสเตรทตัวใดก็ ตาม จะมีผลในการลดปริมาณ H2O2 และ O2 ลงตามลำดับ นอกจากนั้นคณะวิจัยยังพบว่าทั้ง ปริมาณเปอร์ออกซิเดสจากเปลือกนอกของไม้ยาง ที่ได้จากการกรีด และปริมาณสารฟีนอลในซี-ซี รั่มของน้ำยาง จะสัมพันธ์โดยตรงกับปริมาณยางที่ได้ต่อครั้งกรีด โดยมีค่าประสิทธิ์ สหสัมพันธ์เท่า กับ 0.76 และ 0.91 ตามลำดับ เมื่อลูทอยด์แตกจะทำให้ลูทอยดิน (lutoidin) ซึ่งพบว่ามีคุณสมบัติเป็นเลคตินที่บริเวณผนัง เมมเบรนของลูทอยด์โผล่ออกมา ทำการเหนี่ยวนำให้เกิดการเกาะกลุ่มของอนุภาคยาง การเกาะ จับจำเพาะของลูทอยดินกับอนุภาคยางนี้ ไม่ได้เกิดขึ้นโดยการทำงานของเอนไซม์ แต่เกิดจากการ ที่ receptor site ของลูทอยดิน สามารถ recognize กลุ่ม ไกลโคโปรตีนบนโปรตีน (rubber particle- lutiodin binding protein, RP-LBP) ที่ผิวของอนุภาคยาง ทำให้เกิดการเกาะจับจำเพาะ และรวมกันเป็นกลุ่มก้อนซึ่งเป็นสาเหตุให้เกิดการอุดตันในท่อน้ำยางได้ โดยเราจะสามารถเห็น ลักษณะการเกาะกลุ่มของอนุภาคยางดังกล่าวได้ จากการทดลองนำลูทอยดินที่แยกและทำบริสุทธิ์ ได้จากผนังเมมเบรนของลูทอยด์มาผสมกับอนุภาคยางในสภาพธรรมชาติเมื่อลูทอยด์แตกแล้ว ซากเมมเบรนของลูทอยด์จะแขวนลอยอยู่ในส่วนที่เป็นของเหลวภายในท่อน้ำยาง ซึ่งคณะผู้วิจัย พบว่าใน ส่วนที่เป็นของเหลวดังกล่าวจะมีไกลโคโปรตีน (cytosol- lutoidin binding protein, C- LBP) อีกชนิดหนึ่งที่สามารถเกาะจับจำเพาะกับลูทอยดิน ได้เช่นกัน ดังนั้นจะเห็นว่าทั้ง RP-LBP และ C-LBP จะต้องแข่งขันกันเกาะจับจำเพาะกับลูทอยดิน และการจับกันระหว่าง RP-LBP ของ อนุภาคยางกับลูทอยดิน เท่านั้นที่จะนำไปสู่การเกาะกลุ่มกันเป็นกลุ่มก้อนเพื่อกีดขวางการไหลของ น้ำยาง นอกจากนั้นยังพบว่าระดับ C-LBP ในซี-ซีรั่มของน้ำยางมีความสัมพันธ์โดยตรงกับปริมาณ ยางที่ได้ต่อครั้งกรีด โดยมีค่าประสิทธิ์สหสัมพันธ์เท่ากับ 0.97 ผลการทำบริสุทธิ์และศึกษาคุณสมบัติทางชีวเคมีของโปรตีนต่างๆ ที่เกี่ยวข้องกับการอุด ตันของท่อน้ำยางทั้งที่ทำหน้าที่เป็นเอนไซม์ซึ่งได้แก่ NAD(P)H ควิโนน รีดัสเตส, เปอร์ออกซิเดส กับโพลี่ฟีนอลออกซิเดส และที่ไม่ใช่เอนไซม์ แต่ก่อให้เกิดหรือยับยั้งการเหนี่ยวนำในการเกาะกลุ่ม ของอนุภาคยางซึ่งได้แก่ ลูทอยดิน, RP-LBP และ C-LBP ที่พอจะสรุปได้มีดังนี้: NAD(P)H ควิโนน รีดัสเตส (QR) สามารถเตรียมได้ B-serum ที่ได้จากการนำ bottom fraction ที่ได้จากการปั่นแยกน้ำยางสดไปผ่านขั้นตอน freeze-thaw จากการทำ IEF พบว่ามี QR หลายชนิด โดยมีค่า pI เท่ากับ 4.6, 5.0, 6.2, 6.7 และ 7.4 โดยชนิดที่มีค่า pI เท่ากับ 6.2 จะมี ปริมาณ QR แอคติวิตีสูงสุด โดยมีค่า Mr จากการทำ SDS-PAGE ประมาณ 57 kD QR มีความ ความจำเพาะต่อสัปสเตรทหลายชนิด ตามลำดับดังนี้ p-benzoquinone>menadione>plumbagin>juglone>duroquinone ตามลำดับ โดยพบว่า dicumarol มีฤทธิ์ในการยับยั้งการทำงานของ QR ส่วน pH ในการทำงานที่เหมาะสมที่สุดคือ 8 โดย QR สามารถทนต่อการเปลี่ยนแปลง pH จากช่วง 6-10 และ ทนอุณหภูมิได้สูงถึง 70oC เปอร์ออกซิเดส สามารถเตรียมได้จากเปลือกนอกของไม้ยางที่ถูกเฉือนออกมาเวลากรีด ยางและพบว่าเปอร์ออกซิเดสนี้สามารถทำหน้าที่เปลี่ยนฟีนอลจากซี-ซีรั่มในน้ำยางให้กลายเป็นโพ ลี่ฟีนอล เราสามารถทำให้เปอร์ออกซิเดสบริสุทธิ์ได้โดยการแยกผ่านคอลัมน์โดยอาศัยคุณสมบัติ ทางขนาด สภาพการมีประจุ และการเกาะจับจำเพาะของเอนไซม์ เมื่อทำบริสุทธิ์แล้วปรากฎว่า เปอร์ออกซิเดส มีค่า Mr จากการทำ SDS-PAGE และน้ำหนักโมเลกุลรวม จากการแยกผ่าน คอลัมน์โดยอาศัยขนาดเท่ากับ 50 kD มีค่า pI เท่ากับ 3.5 และการทำงานที่เหมาะสมที่ pH 5.4. ค่า Km ต่อสัปสเตรท o-dianisidine และ H2O2 เท่ากับ 20 and 18.6 *M ตามลำดับ ค่า Ki ของ ตัวยับยั้ง KCN และ NaN3 เท่ากับ 34 and 41 *M ตามลำดับ โพลี่ฟีนอลออกซิเดส (PPO) สามารถเตรียมได้ B-serum ที่ได้จากการนำ bottom fraction ที่ได้จากการปั่นแยกน้ำยางสดไปผ่านขั้นตอน freeze-thaw โดยนำสารละลายที่ได้จากการ ละลายตะกอน B-serum ที่ได้หลังจากการตกตะกอนด้วยอะซีโตน ไปทำบริสุทธิ์ผ่านคอลัมน์ CM- Sepharose จะได้ PPO I และ PPO II โดยมีค่า Mr ที่ได้จากการทำ SDS-PAGE เท่ากับ 32 และ 34 kD ตามลำดับ และมีค่า pI เท่ากันคือ 9.3 ไอโซเอนไซม์ทั้งสองทำงานได้ดีในช่วง pH 5-8 โดย มีอุณหภูมิในการทำงานที่เหมาะสมอยู่ในช่วง 35-40oC และทนต่ออุณหภูมิได้สูงถึง 60oC เมื่อใช้ dopamine และ L-dopa เป็นสัปสเตรท PPO-I ให้ค่า Km เท่ากับ 2.08 และ 8.33 mM ส่วน PPO-II ให้ค่า Km เท่ากับ 2.12 และ 4.76 mM ตามลำดับ ลูทอยดิน สามารถเตรียมได้จากอนุภาคลูทอยด์ ซึ่งแยกได้จากส่วนของ bottom fraction ที่ได้จากการปั่นแยกน้ำยางด้วยเครื่อง ultracentrifuge โดยการนำไปตกตะกอนด้วยอะซีโตน แล้ว นำตะกอนที่ได้ไปล้างแล้วสกัดด้วยบัฟเฟอร์ที่มี 0.2% Triton X-100 นำสารสกัดที่ได้ไปทำบริสุทธิ์ ต่อโดยการแยกผ่านคอลัมน์ไคติน และ DEAE-Sepharose พบว่าลูทอยดินมีมีค่า Mr ที่ได้จากการ ทำ SDS-PAGE เท่ากับ 17 kD และ น้ำหนักโมเลกุลรวมจากการแยก โดยอาศัยขนาดประมาณ 276 kD ลูทอยดินสามารถทำให้อนุภาคยางเกาะกันเป็นกลุ่มได้ และตัวลูทอยดินเองยัง สามารถทำให้เม็ดเลือดแดงจาก กระต่าย หรือ หนู เกาะกลุ่มได้ด้วย จึงมีคุณสมบัติเป็นเลคติน ซึ่ง ความสามารถในการทำให้เม็ดเลือดแดงเกาะกลุ่มนี้จะถูกยับยั้งโดยไกลโคโปรตีนหลายชนิด คือ fetuin, asialofetuin, ovomucoid, mucin, asialomucin ส่วน *1 -acid glycoprotein หรือ น้ำตาล เดี่ยวหรือคู่หลายตัวจะไม่สามารถทำการยับยั้งดังกล่าวได้ ในทำนองเช่นกัน การเกาะจับของ อนุภาคยางที่ถูกเหนี่ยวนำโดยลูทอยดิน จะสามารถถูกยับยั้งได้ด้วย fetuin แต่ไม่ถูกยับยั้งได้ด้วย น้ำตาลเดี่ยว GlcNAC ลูทอยดินสามารถทนต่ออุณหภูมิได้สูงถึง 60oC และทนต่อความเป็นกรด ด่างได้ดีตั้งแต่ช่วง pH จาก 5-10 RP-LBP สามารถแยกได้จากชั้นบนสุดหรือชั้นของยางที่ได้จากการปั่นแยกน้ำยางด้วย เครื่อง ultracentrifuge โดยแยกเอาเฉพาะบริเวณ zone 2 ซึ่งเป็นชั้นยางด้านที่สัมผัสกับชั้นของ C- serum ซึ่งมีลักษณะคล้ายวุ้นสีขาวใสไปทำบริสุทธิ์โดยการผ่านการล้างด้วย isotonic buffer หลัง จากนั้นทำการสะกัดด้วย 0.2% Triton X-100 นำสารที่สะกัดได้ไปตกตะกอนด้วยอะซีโตน แล้วนำ ตะกอนที่ละลายได้ไปอุ่นในน้ำเดือด 2 นาที แล้วปั่นแยกเอาส่วนใสไปทำบริสุทธิ์ต่อโดยการแยก ผ่านคอลัมน์ โดยอาศัยข้อแตกต่างของขนาดโมเลกุลและความเป็นประจุที่แตกต่างกันของโปรตีน พบว่า RP-LBP ที่ทำบริสุทธิ์ได้ มีค่า Mr ที่ได้จากการทำ native PAGE และ SDS-PAGE เท่ากับ 120 และ 24.5 kD ตามลำดับ มีค่า pI เท่ากับ 5.4 และค่า pH ที่เหมาะสมกับการทำงานในช่วง 5- 8 โดยสามารถทนต่ออุณหภูมิสูงที่ 60oC ได้นานกว่า 30 นาที RP-LBP สามารถยับยั้งการเกาะ กลุ่มของเม็ดเลือดแดงของกระต่ายที่เหนี่ยวนำให้เกิดขึ้นโดยลูทอยดิน โดยสามารถยับยั้งได้ประ สิทธิภาพสูงสุดหรือใช้ความเข้มข้นโปรตีนได้ต่ำสุด เมื่อเทียบกับไกลโคโปรตีนจากแหล่งอื่นๆที่นำ มาทดสอบ นอกจากนี้ยังพบว่าเอนไซม์ไคติเนสสามารถยั้บยั้งการทำงานของ RP-LBP C-LBP สามารถแยกได้จากชั้นของส่วนใสในชั้นกลาง (ซี-ซีรั่ม) ที่ได้จากการปั่นแยกน้ำ ยางด้วยเครื่องultracentrifuge โดยสามารถนำไปทำบริสุทธิ์ได้ ด้วยการตกตะกอนด้วยเกลือ แอมโมเนียมซัลเฟต แล้วแยกผ่านคอลัมน์โดยอาศัยข้อแตกต่างของขนาดโมเลกุลและความเป็น ประจุที่แตกต่างกันของโปรตีน พบว่า C-LBP มีค่า Mr ที่ได้จากการทำ SDS-PAGE เท่ากับ 40 kD และน้ำหนักโมเลกุลรวมจากการแยกผ่านคอลัมน์โดยอาศัยขนาดประมาณ 204 kD มีค่า pI เท่ากับ 4.7 โดยสามารถทนความเป็นกรดด่างได้ตั้งแต่ช่วง pH 6-10 และทนต่ออุณหภูมิสูงถึง 50oC C- LBP สามารถยับยั้งการการเกาะกลุ่มของอนุภาคยางและเม็ดเลือดแดงกระต่ายที่เหนี่ยวนำให้เกิด ขึ้นโดยลูทอยดิน โดยพบว่าไคติเนสสามารถยั้บยั้งการทำงานดังกล่าวของ C-LBP ได้ ทำนอง เดียวกันกับที่พบกับ RP-LBP นอกจากนั้นยังพบว่าปริมาณ C-LBP ในน้ำยางจะมีความสัมพันธ์ โดยตรงกับปริมาตรน้ำยางที่ได้ต่อครั้งกรีด โดยสรุปกระบวนการทางชีวเคมีที่เกี่ยวข้องกับการอุดตันของท่อน้ำยางในต้นยางพาราใน ขั้นแรกเกิดจากการทำงานของกลุ่มเอนไซม์ที่สร้างสารพิษออกซิเจนเพื่อไปทำลายเสถียรภาพของ เมมเบรนของอนุภาคลูทอยด์ทำให้ลูทอยด์แตก ขั้นถัดไปเกิดจากที่ลูทอยดินซึ่งโผล่ออกมาจากเมม เบรนของลูทอยด์หลังการแตก ไปทำหน้าที่เหมือนเลคตินในการจับจำเพาะกับไกลโคโปรตีนบนผิว อนุภาคยาง(RP-LBP) ก่อให้เกิดการรวมตัวกันเป็นกลุ่มก้อนขัดขวางการไหลของน้ำยางและเกิด การอุดตันของท่อน้ำยางในที่สุด กลุ่มสารที่เกี่ยวข้องทั้งหมดนี้รวมเป็น coagulating factors ในทาง กลับกันจะมีกลุ่มสารที่ทำหน้าที่เป็น anti-coagulating factors ซึ่งได้แก่ เปอร์ออกซิเดสและฟีนอล ในซี-ซีรั่ม ที่ส่งผลต่อการลดการเกิดสารพิษออกซิเจนและไกลโคโปรตีน (C-LBP) ในซี-ซีรั่มที่ไปขัด ขวางการเกาะกลุ่มระหว่างลูทอยดินกับอนุภาคยาง โดยพบว่าปริมาณ anti-coagulating factors เหล่านี้จะแปรผันโดยตรงกับปริมาณยางที่ได้ต่อครั้งกรีด ซึ่งสมควรจะพัฒนาใช้เป็นตัวบ่งชี้ศักย ภาพในการไหลของน้ำยางในการคัดเลือกและปรับปรุงพันธุ์ยางพาราต่อไป Rubber latex is a viscous white liquid synthesized and stored in latex vessel. Besides a major liquid cytosol (C-serum) content in rubber latex, various suspended particles, in decreasing quatities, are rubber particles, lutoids and Frey-Wyssling complex, respectively. Rubber tapping was performed by making cuts across latex vessels. The rubber tree has a mechanism to minimize its metabolite lost due to tapping by forming plug at the tapping site in order to retard latex flow. An early electron microscopic study revealed the presence of rubber particles and lutoid debris at the plugging site to impede latex flow. Our present study on the biochemical process in latex vessel plugging of Hevea brasiliensis suggests the involvements of two cooperative processes. One is enzymatic dependent leading to lutoid bursting and another is non-enzymatic dependent involving specific aggregation between rubber particles and lutoid membrane debris. Upon tapping, the opening end of latex vessel is exposed to atmospheric O2 which in turn promotes activities of several oxidases leading to production of active oxygen species including superoxide (O2._) , hydroxyl radical (OH.) and H2O2 . These active oxygen species will cause lutoid membrane damage. The process may begin with reduction of quinone into semi-quinone by the NAD(P)H oxidase or NAD(P)H quinone reductase on lutoid membrane. In the presence of O2, the semi-quinone can auto-oxidize into quinone by producing O2._ . The reaction between O2._ with surrounding H2O2 results in formation of OH. ( Fenton & Haber-Weiss reaction). The OH. will cause damage to the unsaturated double bond of fatty acid in lutoid membrane and lead to membrane breakage. Consequently, peroxidase and polyphenol oxidase in latex cytosol will utilize H2O2 and O2, respectively to oxidize hydroquinoe subtrate into its corresponding quinone product, hence increasing further chance on semi- quinone and active oxygen species production. However, opposite outcome may also occur if there are other substrates such as C-serum phenols competing with hydroquinone for these enzymes. Whichever substrate is utilized, the reactions catalyzed by peroxidase and polyphenol oxidase will result in decreasing H2O2 and O2 contents, respectively. Accordingly, we found direct correlations between level of bark peroxidase and C-serum phenols with rubber yield per tapping, r=0.76 and 0.91, respectively. The bursting of lutoid will lead to an exposure of lutoidin, possesing lectin activity, on its membrane. The lutoidin will agglutinate particle particles. The aggregation of rubber particles is a non-enzymatic process involving recognition of glycoprotein (rubber particle- lutoidin binding protein, RP-LBP) on rubber particle by its receptor site on the lutoidin. These specific bindings led to rubber plug formation in latex vessel to retard flow. The agglutination of rubber particles can be demonstrated in vitro by mixing lutoidin, purified from lutoid membrane with rubber particles. In the in vivo situation, after lutoid breakage its membrane debris remained suspending in latex cytosol where another glycoprotein that can bind to lutoidin (cytosol- lutoidin binding protein, C-LBP) was also found. Therefore, it is seen that both RP-LBP and C-LBP will have to compete for lutoidin binding and only with the former that rubber particle aggregation can be formed to impede latex flow. Accordingly, the level of C-LBP is directly proportional to rubber latex yield per tapping, with r=0.97. The results obtained from purification and chracterizations of proteins involved in latex vessel plugging on the enzymatic process including NAD(P)H quinone reductase, peroxidase and polyphenol oxidase and the non-enzymatic process leading to rubber particle aggregation including lutoidin, RP-LBP and C-LBP can be summarized as follows: NAD(P)H quinone reductase (QR) was prepared from B-serum, obtained from bottom fraction of ultracentrifuged fresh latex, by repetitive freeze-thawing. Upon IEF, several QRs were found with pIs of 4.6, 5.0, 6.2, 6.7 and 7.4 The most dominant form of QR possesed pI value of 6.2 and Mr of 57 kD upon SDS-PAG. Different substrate specificities on QR were detected as follows: p-benzoquinone>menadione>plumbagin>juglone>duroquinone, respectively. Dicumarol was found to inhibit QR activity. Optimum pH was observed at 8 while pH stability ranging from 6-10. QR is heat stable up to 70oC. Peroxidase was prepared from excised Hevea bark strips obtainded after tapping. The bark peroxidase was capable to convert phenols isolated from C-serum fraction of centrifuged latex into polyphenolic forms. The peroxidase was purified to homogeneity by size exclusion, ion exchange and affinity chromatography. SDS-PAGE and gel filtration chromatography indicates that purified peroxidase is composed of a single polypeptide of Mr 50 kD. The enzyme has a pI of 3.5. The Km values for o-dianisidine and H2O2 were 20 and 18.6 *M, respectively, and the Ki values for KCN and NaN3 for these substrates were 10 *M and 2.7 mM, respectively. Polyphenol oxidase (PPO) was prepared from B-serum by repetitive freeze- thawing of bottom fraction obtained from ultracentrifuged fresh latex. The B-serum was subjected to acetone precipitation and the solubilized precipitate was further purified through CM-Sepharose column. Two PPO were obtained, PPO-I and PPO-II with Mr under SDS-PAGE of 32 and 34 kD, respectively. Both PPOs possess pI of 9.3 and have optimum pH and temperature ranging from 5-8 and 35-40oC, respectively. They are heat up to 60oC. The Kms values of PPO-I for dopamine and L-dopa are 2.08 and 8.33 mM, respectively while those for PPO-II are 2.12 and 4.76 mM , respectively. Lutoidin was isolated from lutoid (bottom) fraction of centrifuged rubber latex under acetone precipitation. Lutiodin was extracted from the acetone precipitate in buffer containing 0.2% Triton X-100 and purified to homogeneity after chitin and DEAE- Sepharose column. The Mr upon SDS-PAGE is 17 kD with native Mr obtained by gel filtration of 276 kD It is able to agglutinate rubber particles and erythrocytes from either rabbit or mouse. The hemagglutination or lectin activity of lutoidin can be inhibited by several glycoproteins such as fetuin, asialofetuin, ovomucoid, mucin, asialomucin but not *1 -acid glycoprotein , mono- or di-saccharides. Similarly, the ability of lutoidin in inducing rubber particle aggregation was also inhibited by fetuin but not monosugar like GlcNAC. Lutoidin is heat stable up to 60oC and its pH stability ranging from 5-10. RP-LBP was isolated from rubber layer obtained after ultracentrifugation of fresh latex. The zone 2 of rubber layer facing aqueous C-serum phase with white jelly-like appearance was isolated and washed with isotonic buffer. RP-LBP was then extracted in the presence of 0.2% Triton X-100. Acetone precipitation was performed on the extract and resultant pellet was solubilized and dipped in boiling water for 2 min. RP-LBP was further purified from supernatant obtained after heat-treatment by passing through gel filtration and ion exchange column chromatography. Purified RP-LBP possessed Mr of 120 and 24.5 kD upon native PAGE and SDS-PAGE, respectively. The pI value was determined to be 5.4 while pH optimum ranging from 5-8. It could stand heat at 60oC for more than 30 min. The RP-LBP was able to inhibit hemagglutination induced by lutoidin with highest binding efficiency since its concentration required for inhibition was lowest in comparison with other glycoprotein inhibitors used under the same study. In addition, the lutoidin binding capacity of RP-LBP was abolished upon chitinase treament. C-LBP was purified from C-serum fraction in middle aqueous phase obtained after ultracentrifugation of fresh latex. The purification procedure involved ammonium sulfate fractionation, gel filtration and ion exchange column chromatography. Purified C-LBP possessed Mr of 40 kD upon SDS-PAGE. The native molecular weight obtained after gel filtration was 204 kD. The pI value was around 4.7 while a broad range of pH atibility was observed from 6-10. It is heat stable up to 50oC. Purified C-LBP could inhibit both rubber particle aggregation and hemagglutination induced by the lutoidin. These inhibitions are, however, abolished with pre-treatment of C-LBP with chitinase, similar to that observed with RP-LBP. Moreover, a direct correlation between latex C-LBP level and rubber latex yield per tapping was also found. In conclusion, the biochemical process in latex vessel plugging of Hevea brasiliensis begins with the production of active oxygen species by a group of oxidase enzymes. These destructive active oxygen species then causes lutoid membrane destabilization leading to an exposure of lutoidin. The lutodin, also possessed lectin activity, will agglutinate rubber particles by binding specifically with glycoprotein (RP-LBP) on rubber particle surface. The aggregate thus formed will impede or eventually cease latex outflow. Overall compounds involved in this process are functioning as coagulating factors. On contrary, there is also a group of anti-coagulating factors such as peroxidase and C-serum phenol playing role in reducing the amount of active oxygen species and C-serum glycoprotein (C-LBP) which competes with RP-LBP in binding with lutoidin in forming rubber particle aggregate. It was found that the levels of these anti-coagulating factors are directly and highly correlated to the amount of latex yield per tapping. Hence, the anti-coagulating factors should be applied as potential markers in characterization and selection of better-yield rubber clones.

บรรณานุกรม :
รพีพรรณ วิทิตสุวรรณกุล . (2541). กระบวนการทางชีวเคมีที่เกี่ยวข้องกับการอุดตันของท่อยางในต้นยางพารา.
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย.
รพีพรรณ วิทิตสุวรรณกุล . 2541. "กระบวนการทางชีวเคมีที่เกี่ยวข้องกับการอุดตันของท่อยางในต้นยางพารา".
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย.
รพีพรรณ วิทิตสุวรรณกุล . "กระบวนการทางชีวเคมีที่เกี่ยวข้องกับการอุดตันของท่อยางในต้นยางพารา."
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย, 2541. Print.
รพีพรรณ วิทิตสุวรรณกุล . กระบวนการทางชีวเคมีที่เกี่ยวข้องกับการอุดตันของท่อยางในต้นยางพารา. กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย; 2541.