ridm@nrct.go.th   ระบบคลังข้อมูลงานวิจัยไทย   รายการโปรดที่คุณเลือกไว้

การปรับปรุงการผลิตแอลกอฮอล์ของโครงการส่วนพระองค์สวนจิตรลดา

หน่วยงาน สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย

รายละเอียด

ชื่อเรื่อง : การปรับปรุงการผลิตแอลกอฮอล์ของโครงการส่วนพระองค์สวนจิตรลดา
นักวิจัย : สาวิตรี ลิ่มทอง
คำค้น : alcohol , alcohol production , Bacteria Flocculent Yeast for Ethanol , ethanol fermentation , Lactic Acid , Saccharomyces cerevisiae , Yeast , การหมักแอลกอฮอล์ , ยีสต์ , ยีสต์อาหารสัตว์ , เอทานอล , แบคทีเรียแลคติก , แอลกอฮอล์
หน่วยงาน : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย
ผู้ร่วมงาน : -
ปีพิมพ์ : 2548
อ้างอิง : http://elibrary.trf.or.th/project_content.asp?PJID=RDG4450053 , http://research.trf.or.th/node/1245
ที่มา : -
ความเชี่ยวชาญ : -
ความสัมพันธ์ : -
ขอบเขตของเนื้อหา : -
บทคัดย่อ/คำอธิบาย :

โครงการย่อยที่ 1 :ยีสต์ตะกอนสำหรับการผลิตเอธานอลและยีสต์อาหารสัตว์ จาก Saccharomyces cerevisiae สายพันธุ์ตกตะกอน 4 สายพันธุ์ คัดเลือกได้ S. cerevisiae M30 ที่มีประสิทธิภาพสูงสุดสำหรับการหมักเอธานอล ในอาหารกากน้ำตาล ที่อุณหภูมิสูง และตกตะกอนได้ดี โดย M30 หมักเอธานอลจากอาหารกากน้ำตาล ที่มีน้ำตาลเริ่มต้น 18% เมื่อหมักแบบ batch ที่ 35?ซ ได้สูงที่สุด 8.48 % โดยปริมาตร ที่เวลา 30 ชั่วโมง เท่า ๆ กันกับ Sc90 ซึ่งให้เอธานอล 8.42% โดยปริมาตร ที่เวลาเดียวกัน โดย M30 มีอัตราการหมักเร็วกว่าเล็กน้อย ทั้ง M30 และ Sc90 หมักเอธานอลได้ที่ 37?ซ แต่ให้เอธานอลปริมาณลดลงเกือบครึ่งของการหมักที่ 35?ซ และทั้ง M30 และ Sc90 ไม่เจริญที่ 40?ซ การหมักอาหารกากน้ำตาล ที่อุณหภูมิสูง โดยการหมักแบบ batch ในฟลาสก์เขย่า แสดงว่าการใช้แอมโมเนียมซัลเฟต หรือยูเรีย เป็นแหล่งไนโตรเจน ไม่ได้ทำให้การหมักแตกต่างกัน การเพิ่มความเข้มข้นของน้ำตาลในอาหารจาก 18 เป็น 20% โดยเพิ่มปริมาณกากน้ำตาล มีผลให้ M30 หมักเอธานอลได้สูงขึ้นเล็กน้อย ที่ pH เริ่มต้นเท่ากับ 5.0 M30 หมักได้เร็วกว่าที่ pH 4.5 เล็กน้อย แต่เอธานอลสูงสุดที่หมักได้ไม่แตกต่างกัน ส่วนในอาหารที่มี pH 4.0 นั้น ทั้ง M30 และ Sc90 ไม่เจริญ การเติมโปแตสเซียมไฮโดรเจนฟอสเฟตความเข้มข้นต่ำลงในอาหารนั้น M30 หมักเอธานอลได้ไม่แตกต่างกัน แต่เมื่อเติมมากไปกลับทำให้การหมักเอธานอลลดลง ทำการวิเคราะห์การตกตะกอนของM30 เมื่อหมักเอธานอลจากอาหารกากน้ำตาลในถังหมัก ที่อุณหภูมิสูง โดยการวัดทั้งในรูปของ sedimentation efficiency (S.E.) ความสูงของตะกอน รวมทั้งจำนวนและขนาดของตะกอน พบว่าเมื่อเชื้อมีอายุขึ้นมีการตกตะกอนเพิ่มขึ้น รวมทั้งการเพิ่มจำนวนและขนาดตะกอน จนช่วงท้ายของการหมัก 42-48 ชั่วโมง การตกตะกอนจึงลดลง เชื้อที่หมักเอธานอลที่ 30 33 35 และ 37?ซ นาน 48 ชั่วโมง มี S.E. เท่ากับ 0.35, 0.39, 0.33 และ 3.5 ตามลำดับ โดยเมื่อหมักที่ 35 องศาเซลเซียส นาน 30 ชั่วโมง เซลล์ตกตะกอนได้ดีว่าที่เวลาอื่น (S.E. 0.59) การตกตะกอนเมื่อหมักเอธานอลในอาหารกากน้ำตาล 80 ลิตร ในถังหมัก 100 ลิตร ที่ 35?ซ แสดงว่าการตกตะกอน ในรูปของค่า S.E. นั้นสูงสุด (0.72) เมื่อเชื้อมีอายุ 42 ชั่วโมง สำหรับการวัดในรูปของความสูงของตะกอนนั้น เมื่อหมักเอธานอลนาน 30 ชั่วโมง วัดความสูงของตะกอนได้สูงสุด และความสูงของตะกอนค่อนข้างคงที่ ในระหว่างที่เชื้อมีอายุ 30-42 ชั่วโมง แต่ที่ 48 ชั่วโมง การตกตะกอนของเซลล์ลดลง สำหรับขนาดของตะกอนนั้น พบว่าเมื่ออายุของเชื้อเพิ่มขึ้น ขนาดของตะกอนเซลล์เพิ่มขึ้น และเมื่อเชื้ออายุ 30 ชั่วโมง ตะกอนมีขนาดใหญ่สุด จากนั้นขนาดลดลงเล็กน้อย แต่คงที่ที่ 36-48 ชั่วโมง และในระหว่างการหมักในถังหมัก 5 ลิตร ที่ 33 และ 35?ซ ในช่วง 0-42 ชั่วโมงนั้น พบเซลล์ในถังหมักเป็นเซลล์ที่มีชีวิตสูงกว่า 92% ของเซลล์ทั้งหมด แต่เมื่อหมักในถังหมักขนาด 100 ลิตร เฉพาะ 24 ชั่วโมงแรกเท่านั้น ที่พบเซลล์มีชีวิตสูงกว่า 92% ของเซลล์ทั้งหมด และเมื่อหมักนาน 30 ชั่วโมง เซลล์มีชีวิตลดลงเป็น 86.9% แต่ไม่ลดลงอีกจนหมักครบ 48 ชั่วโมง นอกจากนั้นยังพบว่าเชื้อจากถังหมักอายุ 30 ชั่วโมง สามารถนำกลับไปหมักเอธานอลใหม่ ได้ดีกว่าเชื้ออายุ 24 และ 36 ชั่วโมง และในการหมักเอธานอลของ M30 ร่วมกับ Sc90 ไม่มีผลต่ออัตราการหมักและความเข้มข้นของเอธานอลที่ได้ แต่ทำให้การตกตะกอนลดต่ำลงมาก การตรวจจำนวนรอยแผลจากการแตกหน่อ โดยใช้กล้องจุลทรรศน์อีเลคตรอน แสดงว่าเมื่อเซลล์มีอายุมากขึ้น พบมีรอยแผลจากการแตกหน่อมากขึ้น และการเติมเอธานอล 5% โดยน้ำหนัก ลงในอาหารกากน้ำตาล และตรวจการเจริญในสภาวะการหมักเอธานอล มีผลให้การเจริญของ M30 ลดลงกว่าครึ่ง และเอธานอล 8% โดยน้ำหนัก ยับยั้งการเจริญ M30 ได้อย่างสมบูรณ์ โดยเอธานอลที่เติมลงในอาหารสำหรับหมัก มีผลต่อการเจริญในสภาวะการหมัก มากกว่าสภาวะการเจริญ จากการคัดเลือก S. cerevisiae สายพันธุ์ที่มีการเจริญและให้โปรตีนสูง เมื่อเลี้ยงในอาหารกากน้ำตาล ที่อุณหภูมิสูง (37?ซ) ได้ RL-6 ซึ่งเป็นสายพันธุ์ที่ไม่ตกตะกอน AM12 ซึ่งเป็นสายพันธุ์ตก-ตะกอน และ M30 ที่มีความสามารถในการตกตะกอนสูงกว่าสายพันธุ์อื่น สำหรับการผลิตเซลล์ เมื่อเลี้ยงในอาหารกากน้ำตาล ในฟลาสก์แบบเขย่าแรง ที่อุณหภูมิสูง พบยีสต์ทั้ง 3 สายพันธุ์ (RL-6, AM12 และ M30) เจริญเมื่อใช้ยูเรีย เป็นแหล่งไนโตรเจน ดีกว่าแอมโมเนียมซัลเฟต โดยเมื่อใช้ยูเรีย 0.1% ทั้งสามสายพันธุ์เจริญดีที่สุด และ M30 และ AM12 มีโปรตีนทั้งหมด (total protein) สูงด้วย การปรับน้ำตาลของอาหารกากน้ำตาลให้เท่ากับ 4% ทั้ง 3 สายพันธุ์ให้เซลล์ความเข้มข้นสูงสุด รวมทั้งให้โปรตีนทั้งหมด และโปรตีนในเซลล์สูงสุดด้วย โดยที่ pH ของอาหารเท่ากับ 4.5 ทั้ง 3 สายพันธุ์ ให้เซลล์สูงกว่าเมื่อเลี้ยงในอาหารที่มี pH 4.0 และ 5.23 ประมาณ 1.5-2.6 เท่า ในขณะที่ให้โปรตีนทั้งหมดสูงกว่าประมาณ 1.9-3.5 เท่า อุณหภูมิที่มีผลให้ RL-6 มีการเจริญและโปรตีนทั้งหมดสูง คือ 33?ซ ส่วน AM12 การบ่มที่ 33 และ 35?ซ ให้เซลล์เท่ากัน แต่เมื่อเลี้ยงที่ 33?ซ มีโปรตีนทั้งหมดสูงกว่าที่ 35?ซ เล็กน้อย และสำหรับ M30 ผลิตเซลล์และให้โปรตีนทั้งหมดสูงสุด ที่ 30-33?ซ ความเข้มข้นของเซลล์เริ่มต้นมีผลต่อการผลิตเซลล์ และโปรตีนในเซลล์ โดย RL-6, AM12 และ M30 เมื่อใช้เซลล์เริ่มต้นวัดเป็นOD660 เท่ากับ 1.5, 2 และ 1.5-2 ให้เซลล์และโปรตีนในเซลล์สูงสุด จากผลการศึกษาสภาวะที่เหมาะสมแสดงว่า M30 ให้เซลล์ความเข้มข้นสูงเท่า ๆ กับ AM12 และต่ำกว่า RL-6 เพียงเล็กน้อยเท่านั้น แต่ M30 ให้โปรตีนทั้งหมดสูงกว่า และยังตกตะกอนได้ดีกว่า AM12 การตกตะกอนของ M30 เมื่อหมักแบบให้อากาศ ในอาหารกากน้ำตาล โดยใช้ถังหมักแบบ air-lift ที่โครงการย่อยที่ 2 พัฒนาขึ้น ที่ไม่มีการควบคุมอุณหภูมิ พบว่า M30 มีการตกตะกอนสูงมาก (S.E.= 0.74) เมื่อสิ้นสุดการหมักแบบให้อากาศ (48 ชั่วโมง) แต่เมื่อวัดการตกตะกอนในรูปความสูงของตะกอนเมื่อตั้งไว้ กลับพบว่าเมื่อเชื้ออายุ 36 ชั่วโมง ตกตะกอนได้ดีกว่าเชื้ออายุ 48 ชั่วโมง ประมาณ 2.5 เท่า และสำหรับจำนวนและขนาดของตะกอนเซลล์นั้น เพิ่มขึ้นเมื่อเชื้ออายุมากขึ้น โดยพบมากเมื่อเชื้อมีอายุตั้งแต่ 36 ชั่วโมง ในระหว่างการหมักแบบให้อากาศช่วง 0-36 ชั่วโมง เซลล์ทั้งหมดในอาหารเป็นเซลล์ที่มีชีวิต โดยเซลล์เพิ่มจาก 5.50 x 106 เซลล์/มล. เป็น 4.50 x 108 เซลล์/มล. และที่ 48 ชั่วโมง เซลล์มีชีวิตลดลงเหลือ 97.6% การผลิตเซลล์ที่มีโปรตีนในเซลล์สูง เมื่อเลี้ยง M30 ร่วมกับ Candida utilis IFRPD6014 โดยการหมักแบบให้อากาศ ในอาหารกากน้ำตาล ในถังหมักแบบ air-lift ที่ไม่ปรับอุณหภูมิ แสดงว่าการใช้ M30 มีการผลิตเซลล์ในอัตราที่เร็วกว่าในช่วง 30 ชั่วโมงแรกของการหมักแบบให้อากาศ แต่เมื่อครบ 36 ชั่วโมง เซลล์ที่ผลิตได้มีความเข้มข้นเท่า ๆ กัน โดยการใช้ M30 ให้เซลล์ 18.10 กรัม/ลิตร เมื่อใช้ M30 ร่วมกับ C. utilis ให้เซลล์ 17.03 กรัม/ลิตร และเมื่อใช้ C. utilis ให้เซลล์ 16.73 กรัม/ลิตร สำหรับโปรตีนทั้งหมด และโปรตีนในเซลล์ เมื่อเลี้ยง M30 นั้นสูงกว่า เมื่อใช้ M30 ร่วมกับ C. utilis หรือเมื่อใช้ C. utilis มาก และเมื่อใช้ M30 เซลล์มีการตกตะกอนสูงมาก แต่เมื่อใช้ M30 กับ C. utilis กลับไม่พบการตกตะกอน เช่นเดียวกับเมื่อใช้ C. utilis เนื่องจากเซลล์ M30 ที่ได้จากการหมักแบบให้อากาศ ในอาหารกากน้ำตาล โดยใช้ถังหมักแบบ air-lift ซึ่งไม่ปรับอุณหภูมิ ตกตะกอนได้ดีมาก ดังนั้นการทดลองใช้สารอนินทรีย์ 4 ชนิด (aluminum sulfate, ferric chloride, ferrous sulfate และ potassium sulfate) เติมลงไปในเมื่อสิ้นสุดการหมัก จึงไม่ทำให้มีการตกตะกอนเพิ่มขึ้น จากการคัดเลือก S. cerevisiae สำหรับผลิตยีสต์โปรตีน เมื่อใช้อาหารน้ำกากส่า ได้ M30 ซึ่งมีการเจริญและตกตะกอนได้ดีที่สุด นอกจากนี้ยังมีโปรตีนทั้งหมดสูง ในการทดลองพบว่ายีสต์ใช้น้ำตาลไปเพียง 0.7-0.8% ซึ่งเท่ากับปริมาณน้ำตาลที่มีอยู่ในน้ำกากส่า ดังนั้นในการทดลองหาสภาวะที่เหมาะสมของการผลิตเซลล์ของ M30 ในอาหารน้ำกากส่า จึงไม่ได้ปรับปริมาณน้ำตาลเริ่มต้น และทำการหมัก ในฟลาสก์แบบเขย่าแรง ที่อุณหภูมิสูง (37?ซ) พบว่า M30 มีการเจริญในอาหารน้ำกากส่า ที่มีแอมโมเนียมซัลเฟต หรือยูเรีย เป็นแหล่งไนโตรเจน ไม่แตกต่างกันนัก ในอาหารน้ำกากส่าที่ปรับ pH เริ่มต้นเท่ากับ 4 M30 มีการเจริญและโปรตีนทั้งหมดสูงกว่า การเลี้ยงในอาหารที่ปรับ pH เท่ากับ 4.5 และ 5 โดย M30 มีการเจริญและโปรตีนทั้งหมดสูงสุด เมื่อบ่มที่ 37 ?ซ ในการศึกษาขนาดตะกอนของยีสต์ M30 เมื่อเลี้ยงที่อุณหภูมิสูง ในอาหารน้ำกากส่า แสดงว่าเมื่อเชื้ออายุ 24 ชั่วโมง ยีสต์ M30 สร้างตะกอนเซลล์ขนาดใหญ่ที่สุด ส่วนการเลี้ยง M30 ร่วมกับ C. utilis IFRPD6014 นั้น ทำให้มีมีการผลิตเซลล์เร็วกว่า และมากกว่า การใช้เฉพาะ M30 แต่มีการตกตะกอนลดลง โครงการย่อยที่ 2 การปรับปรุงประสิทธิภาพการหมักแอลกอฮอล์โดยเทคนิค fed-batch ร่วม กับการนำเซลล์กลับมาใช้ จากการศึกษาลักษณะการทนอุณหภูมิของ M30 ต่อการหมักแอลกอฮอล์แบบ batch ในถังหมักระดับห้องปฏิบัติการพบว่า M30 สามารถหมักแอลกอฮอล์ที่ 35?C ได้สูงถึง 8.91 %โดยปริมาตร ภายใน 36 ชั่วโมง และยังคงความสามารถในการตกตะกอนได้ดี (SE = 0.33) และเมื่อทำการหมักแบบ fed-batch พบว่าสามารถลดระยะเวลาการหมักลงเหลือ 24-36 ชั่วโมงต่อรุ่น โดยจำนวนครั้งของการเติมอาหาร (1 หรือ 2 หรือ 3 ครั้ง) ไม่มีผลต่อระยะเวลาการหมัก และค่า SE สูงกว่า 0.45 ในทุกการทดลอง การหมักแอลกอฮอล์ในถังขนาดใหญ่ระดับกึ่งโรงงาน (ความจุ 100 ลิตร) โดย M30 ทั้งระบบ batch และ fed-batch ที่ 35?C ก็ได้ผลใกล้เคียงกับการหมักในระดับห้องปฏิบัติการ คือการหมักแบบ batch ใช้เวลา 42 ชั่วโมงได้แอลกอฮอล์ 8.38 % โดยปริมาตร แต่เมื่อหมักแบบ fed-batch จะได้แอลกอฮอล์ 8.24 % โดยปริมาตร ภายใน 32 ชั่วโมง โดยที่ความสามารถในการตกตะกอนยังคงเดิมที่ค่า SE = 0.33 เมื่อนำข้อมูลที่ได้มาปรับใช้ในระบบ repeated fed-batch พบว่าการหมักในรอบแรกจะค่อนข้างช้า ใช้ระยะเวลาในการหมัก 36 ชั่วโมง และได้ปริมาณแอลกอฮอล์ค่อนข้างต่ำ (6.49% โดยปริมาตร) แต่ตั้งแต่รอบที่ 2 เป็นต้นไประยะเวลาการหมักจะลดลงมาเหลือ 24 ชั่วโมง และได้ปริมาณแอลกอฮอล์สูงสุด (9.36 %โดยปริมาตร ใน repeat batch 1 แต่ค่อยๆลดลงมาจนถึง 7.13 %โดยปริมาตร ใน repeat batch 5) ทั้งนี้เนื่องจากจำนวนเซลล์เริ่มต้นสูงขึ้น โดยที่ค่า OD เริ่มต้นในรอบแรกที่ 0.63 เพิ่มสูงเป็น 8.06, 11.51, 6.81, 9.61 และ 11.41 ในรอบต่อๆมาตามลำดับ แต่เป็นที่น่าสังเกตว่าเมื่อจำนวนรอบเพิ่มขึ้น ความเข้มข้นสูงสุดของแอลกอฮอล์ที่ได้จะลดลงเป็นลำดับ ซึ่งน่าจะเป็นอิทธิพลร่วมของอุณหภูมิ แอลกอฮอล์ และการสะสมของสารพิษอื่นๆ จากการทดลองต่อมาด้วยเทคนิค double stage fed-batch fermentation ซึ่งทำ repeat batch หลังจากหมักไปได้ 12 ชั่วโมง โดยการปล่อยให้เซลล์ตกตะกอน 10 นาที แล้วแยกน้ำส่าด้านบนออก ให้เหลือน้ำส่าบริเวณก้นถัง 600 มล. จากนั้นเติมอาหารชุดใหม่ลงไป น้ำส่าที่แยกออกมานำไปหมักต่ออีก 24 ชั่วโมง พบว่าปริมาณแอลกอฮอล์ที่ได้ในรอบที่ทำ repeat batch ค่อนข้างคงที่อยู่ในระดับสูงกว่า 8 %โดยปริมาตร ภายใน 24 ชั่วโมงของการหมัก จึงสามารถสรุปได้ว่า M30 มีศักยภาพสูงในการนำไปใช้ในการหมักแอลกอฮอล์เพื่อใช้เป็นเชื้อเพลิง โดยใช้เทคนิค repeated fed-batch ที่สามารถผลิตแอลกอฮอล์ต่อรุ่นได้ภายใน 12 ชั่วโมง ซึ่งคิดเป็นประสิทธิภาพในการผลิตเท่ากับ 70.78 กรัม/ลิตร/สัปดาห์ เทียบกับโรงงานแอลกอฮอล์โครงการส่วนพระองค์สวนจิตรลดาที่ทำได้อยู่เดิมเท่ากับ 7.9 กรัม/ลิตร/สัปดาห์ ทางด้านการผลิตเซลล์ยีสต์เพื่อใช้เป็นอาหารสัตว์ ใช้ถังหมักแบบ air-lift ในการศึกษานี้ได้พัฒนาต้นแบบถังหมักโดยใช้โหลแก้วทรงกระบอกขนาด 33 x 15 ซม. ความจุ 5 ลิตร ส่วน draught tube ทำจากท่อพลาสติก PVC ขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง 9 ซม. สูง 12 ซม. ด้านล่างสุดของท่ออยู่ห่างจากพื้นถัง 2.5 ซม. บริเวณก้นถังตรงมุมพอกเป็นแนวโค้ง เพื่อป้องกันการสะสมตะกอนเซลล์ ในการศึกษาเรื่องสภาวะที่เหมาะสมต่อระบบการหมักแบบ air-lift พบว่า ปริมาณอากาศที่เหมาะสม คือ 0.75 vvm ระดับความเข้มข้นของสารอาหารที่เหมาะสมประกอบด้วยน้ำตาล 4% ยูเรีย 0.1% และ KH2PO4 0.05% โดยใช้ pH เริ่มต้น 4.5 ซึ่งหลังจากเพาะเลี้ยงได้ 36 ชั่วโมง จะได้เซลล์ยีสต์ 17.52 กรัม/ลิตร แต่ปริมาณโปรตีนต่ำมาก คือ 3.28 กรัม/ลิตร ซึ่งเมื่อคิดเป็นโปรตีนในเซลล์จะอยู่ที่ระดับเพียง 18.7 % แต่ในการทดลองเพิ่มปริมาณยูเรียในอาหารเลี้ยงเชื้อพบว่าไม่สามารถให้ได้มากกว่า 0.1% ซึ่งอาจจะเป็นผลมาจากความเป็นพิษของแอมโมเนียที่ได้มาจากการสลายตัวของยูเรีย จึงทำการเติมยูเรียเป็นระยะ (incremental feeding) ในอัตรา 0.3% แบ่งใส่ตามสัดส่วนและระยะเวลาที่ 12 24 และ 36 ชั่วโมง พบว่ายังคงมีผลในเชิงลบต่อการเจริญของ M30 คือได้จำนวนเซลล์ลดลงจาก 17.99 กรัมต่อลิตรในชุดควบคุม เหลือเพียง 12.93 11.80 และ 13.39 กรัมต่อลิตร นอกจากนี้ปริมาณผลผลิตโปรตีนโดยรวมก็ลดลงด้วย จึงได้เปลี่ยนวิธีการเติมใหม่โดยลดปริมาณยูเรียที่เติมและเปรียบเทียบการใช้แอมโมเนียมซัลเฟตแทนด้วย พบว่าเมื่อทำการเติมยูเรียในอัตรา 0.1% ในชั่วโมงที่ 12 และอีก 0.1% ในชั่วโมงที่ 24 จะสามารถเพิ่มปริมาณโปรตีนในเซลล์ได้สูงขึ้นเป็น 45% แต่จากผลการใช้น้ำตาลเริ่มต้นเพียง 4% ทำให้ได้เซลล์เพียง 17.99 กรัม/ลิตร จึงได้ทดลองเพิ่มปริมาณน้ำตาลเริ่มต้นในอาหารอีกพบว่าการเพิ่มน้ำตาลตั้งแต่เริ่มต้นสามารถเพิ่มปริมาณเซลล์ได้เพียงเล็กน้อย แต่จะมีการสะสมของแอลกอฮอล์และน้ำตาลคงเหลือมากขึ้น ดังนั้นจึงได้เปลี่ยนวิธีการให้น้ำตาลเป็นระยะที่อัตราและสัดส่วนต่างๆ พร้อมกับให้แหล่งไนโตรเจนด้วย พบว่าการให้น้ำตาลอีก 2 ครั้งๆละ 4% ในชั่วโมงที่ 12 และ 24 ร่วมกับการให้ยูเรียในอัตราครั้งละ 0.1% สามารถเพิ่มปริมาณเซลล์สูงสุดได้เป็น 25.86 กรัม/ลิตร แต่จะมีการสะสมของแอลกอฮอล์สูงถึง 20.6 กรัม/ลิตร ซึ่งแสดงว่าการเติมน้ำตาลยังไม่สัมพันธ์กับการเจริญ ดังนั้นจึงได้เปรียบเทียบรูปแบบการให้น้ำตาลใหม่ 3 แบบ คือ การเติมอัตราคงที่ (linear feeding) การเติมอัตราลอกาลิทึม (exponential feeding) และ การเติมตามอัตราการเจริญ (sigmoidal feeding) โดยเพิ่มจำนวนการเติมให้มากครั้งขึ้น (ทุก 2 ชั่วโมงหลังจากชั่วโมงที่ 14) ปรากฏว่า M30 มีอัตราการเจริญได้ใกล้เคียงกันทั้ง 3 แบบ โดยมีปริมาณเซลล์สูงสุด 32.26 32.66 และ 33.91 กรัม/ลิตร ตามลำดับ และได้ผลผลิตโปรตีน 16.22 16.05 และ 16.98 กรัม/ลิตรตามลำดับ ซึ่งเมื่อคำนวณเป็นปริมาณโปรตีนในเซลล์จะได้ 50.3 49.1 และ 50.1 % ตามลำดับ ในการทดลองผลิตเซลล์ยีสต์ด้วยถังหมักระบบ air-lift ขนาดกึ่งโรงงาน ความจุ 100 ลิตร ใช้ถังหมักที่ประกอบจากถังพลาสติกใช้แล้ว นำมาดัดแปลงใส่ท่อ draught tube ที่ทำจาก fiber glass พบว่าสามารถผลิตเซลล์ยีสต์และปริมาณโปรตีนได้ใกล้เคียงกับที่ได้ในห้องปฏิบัติการภายในระยะเวลาการหมัก คือ 30.58 กรัม/ลิตร และในรุ่นที่ 2 ใช้เวลาเพียง 12 ชั่วโมงจะได้ปริมาณเซลล์สูงถึง 26.59 กรัม/ลิตร และปริมาณโปรตีน 13.83 กรัม/ลิตร : โครงการย่อยที่ 3 โครงการวิจัยกระบวนการหมักเซลล์ยีสต์ร่วมกับแบคทีเรียแลคติก เพื่อใช้เป็นอาหารสัตว์ งานวิจัยนี้ได้มุ่งเน้นถึงการแยกแบคทีเรียแลคติคจากน้ำอ้อยซึ่งสามารถสร้างสารยับยั้งจุลินทรีย์อื่นได้ และศึกษาผลของการยับยั้งที่มีผลต่อการเจริญของยีสต์และแบคทีเรียปนเปื้อนอื่นๆ ในกระบวนการผลิตเซลล์ยีสต์อาหารสัตว์ จากผลการทดลองพบว่าแบคทีเรียแลคติคที่แยกได้จากน้ำอ้อยสามารถยับยั้งแบคทีเรียปนเปื้อนที่พบในน้ำอ้อยและกากน้ำตาลได้ รวมทั้งสามารถยับยั้งการเจริญของแบคทีเรียก่อโรคซึ่งได้แก่ Staphylococcus aureus Listeria inocua Escherichia coli Bacillus cereus และ Salmonella anatum นอกจากนี้ยังสามารถยับยั้งการเจริญของยีสต์Saccharomyces cerevisiae SC90 ได้ แต่ไม่สามารถยับยั้งยีสต์ S. cerevisiae M30 แบคทีเรียแลคติคเหล่านี้จัดอยู่ในกลุ่ม Lactobacillus plantarum Lactobacillus pentosus Lactobacillus coprophilus และ Leuconostoc mesenteroides ในการทดลองต่อมา L. plantarum ได้ถูกเลือกเพื่อใช้ศึกษาความเป็นไปได้ในการลดและป้องกันการปนเปื้อนของแบคทีเรียในกระบวนการผลิตเซลล์ยีสต์ ผลการทดลองจาก batch culture แสดงให้เห็นว่าแบคทีเรียแลคติคนี้สามารถเจริญร่วมกับยีสต์ S. cerevisiae M30 ได้โดยไม่มีผลกระทบต่ออัตราการเจริญจำเพาะของยีสต์ ทั้งในสภาวะที่ใช้อาหารน้ำอ้อยที่ผ่านการฆ่าเชื้อและไม่ผ่านการฆ่าเชื้อก่อนการหมัก และพบว่าที่สภาวะที่มีการเติมแบคทีเรียปนเปื้อนในระดับ 107 cfu/ml ก็จะไม่มีผลกระทบต่ออัตราการเจริญของยีสต์เช่นกัน อย่างไรก็ตามพบว่าผลได้ของเซลล์ทั้งหมดและน้ำหนักเซลล์แห้งสูงสุดใน mixed culture มีค่าลดลงเมื่อเปรียบเทียบกับกรณีที่มียีสต์เพียงอย่างเดียว นอกจากนี้พบว่าแบคทีเรียแลคติคสามารถป้องกันการเจริญของแบคทีเรียปนเปื้อนอื่นๆ ที่มาจากการใช้อาหารน้ำอ้อยที่ไม่ผ่านการฆ่าเชื้อในระหว่างกระบวนการหมักได้ อย่างไรก็ตามผลการทดลอง cyclic fed batch culture (CFBC) แสดงให้เห็นว่าแบคทีเรียปนเปื้อนสามารถเจริญแข่งขันกับยีสต์และแบคทีเรียแลคติคซึ่งเป็นผลให้แบคทีเรียปนเปื้อนเพิ่มจำนวนอย่างรวดเร็วจากฃ 105 เป็น108 cfu/ml ภายใน 24 ชั่วโมง ทั้งนี้อาจเนื่องมาจากสภาวะจำกัดอัตราการเจริญใน CFBC ซึ่งเป็นผลให้แบคทีเรียปนเปื้อนนี้เจริญได้ดีที่สภาวะดังกล่าว โครงการย่อยที่ 4 การเพิ่มประสิทธิภาพการผลิตแอลกอฮอล์ระดับโรงงาน ต้นแบบ โครงงานวิจัยนี้เป็นการศึกษาเพื่อเพิ่มผลผลิตเอทานอลของโครงการส่วนพระองค์สวนจิตรลดา โดยการคุมควบการดำเนินการที่เหมาะสมทั้งกระบวนการหมักและการกลั่นด้วยการปรับปริมาณน้ำตาลรีดิวซ์ตั้งต้น เปอร์เซ็นต์กล้าเชื้อ รวมถึงการควบคุมอุณหภูมิสูงสุด และขั้นตอนดำเนินการการหมักที่เหมาะสม ความเข้มข้นของเอทานอลหลังการหมัก 72 ชั่วโมงจากเดิม 7-8 เปอร์เซ็นต์โดยปริมาตร เพิ่มเป็น 11-12% เปอร์เซ็นต์โดยปริมาตร หรือ 10-11% เปอร์เซ็นต์โดยปริมาตรสำหรับการหมัก 48 ชั่วโมง จากการปรับปรุงการดำเนินในการหมักพร้อมกับการกลั่น ทำให้เพิ่มผลผลิต 95%เอทานอลจาก 640-740 ลิตร (10000 ลิตรของน้ำส่า)ในการหมัก1 ครั้ง เป็น 950-1100 ลิตร (9100 ลิตรของน้ำส่า)ในการหมัก 1 ครั้ง ในกรณีที่ต้องการเพิ่มผลผลิตมากขึ้นสามารถย่นเวลาการหมักเป็น 48 ชั่วโมงทำให้หมักได้อย่างน้อย 2 ครั้งต่อสัปดาห์ กระบวนการต้นแบบที่ปรับปรุงนี้สามารถใช้สำหรับการขยายขนาด และใช้เป็นกระบวนการสาธิตสำหรับการสร้างกระบวนหมักขนาดเล็กในชนบท กระบวนการกำจัดน้ำเสียเป็นปัญหาสำคัญของอุตส่าหกรรมผลิตเอทานอล เนื่องจากในน้ำกากส่ามีสารอินทรีย์ปริมาณสูงจากทั้งเซลล์ยีสต์และน้ำตาลที่เหลือจากการหมักทำให้มีความลำบากในการจัดการน้ำกากส่าเพื่อให้น้ำทิ้งเป็นไปตามข้อกำหนด งานวิจัยนี้จึงได้มีการศึกษาเบื้องต้นถึงการนำน้ำกากส่ามาใช้ทดแทนน้ำบางส่วนในการหมักเพื่อผลิตเซลล์โปรตีนและการหมักเพื่อผลิตเอทานอล จากการทดลองพบว่าปริมาณเปอร์เซ็นต์ที่มากที่สุดของน้ำกากส่าที่สามารถนำมาใช้ทดแทนน้ำขึ้นกับค่าความเข้มข้นของน้ำตาลตั้งต้นโดยรวมของระบบและชนิดของจุลลินทรีย์ที่ใช้ในการหมักของระบบ สำหรับการหมักโดย Saccharomyces cerevisiae M30 พบว่าสามารถใช้น้ำกากส่าทดแทนน้ำได้ในปริมาณ 30-50% Sub project 1 Flocculent Yeast for Ethanol and Fodder Yeast Fermentation Saccharomyces cerevisiae M30 was selected base on high efficiency of ethanol fermentation from molasses at high temperature. In batch fermentation using molasses mash contains 18% glucose equivalent sugar concentration at 35?C M30 could produce the same amounts of ethanol at the same fermentation rate as S. cerevisiae Sc90, a non-flocculent industrial ethanol fermenting strain. In shaking flask cultivation M30 produced 8.48 %v/v at 30 h of cultivation while Sc90 produced 8.42 %v/v. M30 and Sc90 could ferment ethanol at higher temperature, 37?C, however, the amount of ethanol obtained was about a half of ethanol obtained at 35?C. Both strains could not grow at 40?C. Ammonium sulfate and urea that added as nitrogen source did not show any differences in ethanol fermentation by M30. Increasing of initial sugar concentration from 18 to 20% resulted in slightly increasing of ethanol concentration. M30 fermented ethanol in molasses mash that initial pH was 5.0 slightly faster than at pH 4.5 while at pH 4.0 both M30 and Sc90 could not grow at high temperature. Addition of low concentration of potassium hydrogen phosphate did not enhance ethanol fermentation of M30 but addition at high concentration resulted in inhibitory effect. Flocculation of M30 during ethanol fermentation in 3 l of molasses mash in 5l fermentor was analyzed as sedimentation efficiency (S.E.), height of cell sediment after standing including number and size of floc cells. The result revealed that longer fermentation time resulted in increasing of flocculation of cells, however at 42-48 h flocculation decrease. At 48 h of ethanol fermentation at 30, 33, 35 and 37?C the sedimentation efficiency (S.E.) of cells of M30 were 0.35, 0.39, 0.33 and 3.5, respectively. Time-course of flocculation during ethanol fermentation at 35?C in 3 l fermentor indicated that the highest S.E. (0.59) was obtained at 30 h. During ethanol fermentation at 35?C but in 100 l fermentor with 80l of molasses mash cells of M30 showed the highest flocculation (S.E. 0.72) at 42 h. The flocculation analyzed as height of cell sediment was the highest at 30 h and did not change during 30-42 h but decreased at 48 h. Floc size was also largest at 30 h while at 36 h the size was slightly reduced and remained constant during 36-48 h. During 0-42 h of ethanol fermentation of M30 in molasses mash in 5 l fermentor at 33 and 35?C as high as 92% was viable cell. In 100 l fermentor at 35?C only in the first 24 h of fermentation that 92% of the total cell was the viable cell. At 30 h the viable cell was reduced to 86.9% and remained constant until the end of fermentation at 48 h. Cells at 30 h of fermentation showed better fermenting ability when used as inoculum for the next batch of fermentation than cells at 24 and 36 h. Ethanol fermentation by co-cultures of M30 and Sc90 did not showed any improvement of ethanol production. In contrast, the co-cultures reduced flocculation. Observation of bud scar by scanning electron microscope indicated that the number of bud scar increase with increasing in age of cells. Addition of 5% by weight of ethanol reduced growth of M30 to about half in ethanol fermenting condition and 8% by weight of ethanol inhibited growth completely. Selection of S. cerevisiae for fodder yeast production in molasses mash at high temperature (37?C) obtained RL-6 (non flocculent strain), AM12 and M30 (flocculent strains). Production of cell mass in molasses medium using high speed shaking flask cultivation at high temperature of the 3 strains showed that urea was a better nitrogen source than ammonium sulfate. At 0.1% urea all 3 strains revealed the best growth while M30 and AM12 also gave high total protein. When glucose equivalent sugar concentration in molasses mash was adjusted to 4%, all 3 strains produced the highest cell mass with high total protein and protein content. Optimal initial pH for cell mass and total protein production of the molasses mash was 4.5. At pH 4.5 all 3 strains showed 1.5-2.6 times higher in cell mass production than at pH 4.0 and 5.23 (without pH control) and 1.9-3.5 times higher in total protein. Cell mass and total protein production by RL-6 was the highest at 33?C. AM12 provided the high cell mass at 33 and 35?C with higher total protein at 33 ?C than at 35?C. The highest cell mass and total protein production of M30 was obtained at 30-33?C. Initial cell concentration contributed to cell mass and total protein production, initial cell concentration as OD660 at 1.5, 2 and 1.5-2 were the optimal cell concentration for RL-6, AM12 and M30, respectively. The resulted of optimization for cell mass and total protein production indicated that though M30 provided the same amounts of cell mash as AM12 and slightly lower than RL-6 but its total protein was the highest. Moreover, M30 showed stronger flocculation than AM12. Therefore M30 was selected as the best strains for fodder yeast production. Flocculation of M30 cultivated in molasses mash by air-lift fermentor without temperature control was analyzed. The result showed that at the end of aerobic fermentation (48 h) flocculation of M30 was high (S.E.= 0.74). But by measurement of the height of cell sediment the flocculation at 36 was 2.5 time higher than at 48h. The number and size of floc cells were increased at longer cultivation time and at 36 h the highest number and biggest size were obtained. During 0-36 h of aerobic fermentation of M30 almost all cells in the fermenting mash were viable cells and the number of cells increased from 5.50 x 106 to 4.50 x 108 cells/ml after 48 h where 97.6% of cells were viable. Production of cell mass with high protein content in molasses mash using air-lift fermentor by co-cultivation of M30 and C. utilis IFRPD6014 showed that the co-cultures and axenic culture of M30 and C. utilis produced almost the same amount of cell mass, 17.03, 18.10 and 16.73 g/l, respectively. Besides, co-cultivation of M30 and C. utilis caused non-flocculation of M30. Cells of M30 showed very strong flocculation at the end of aerobic fermentation in molasses mash using air-lift fermentor therefore addition of some inorganic compounds (aluminum sulfate, ferric chloride, ferrous sulfate และ potassium sulfate) did not enhance the flocculation. For the production of fodder yeast from slop waste mash S. cerevisiae M30 was also selected based on good growth and high protein production. The result revealed that yeast used only 0.7-0.8% of glucose equivalent sugar concentration which was the same as the concentration in the slop waste. Therefore, no addition of sugar was made in the other experiments. Optimization for cell mass and protein production of M30 in slop waste mash by shaking flask cultivation at 37?C revealed that there was not much different when ammonium sulfate or urea was added as nitrogen source, the optimal pH was 4 while optimal temperature was 37?C. Flocculation analysis of cells during strong shaking flask cultivation at optimal conditions indicated the biggest floc cell sized at 24 h. Co-cultivation of M30 and C. utilis IFRPD6014 in slop waste revealed faster rate and higher cell mass production than using M30 alone. Sub project 2 Improvement of ethanol fermentation efficiency by fed-batch with cell recycle technique Study on thermotolerant properties of Saccharomyces cerevisiae M30 for ethanol fermentation in 5-liter fermentor revealed that this strain could produce highest ethanol concentration at 8.91 %v/v at 35 ?C after 36 hours and still showed good sedimentation efficiency (SE) at 0.33. Reduction of fermentation time to 24-36 hours could be obtained with fed-batch fermentation (1 to 3 times feeding) that yielded similar ethanol contents and SE values. In pilot scale ethanol fermentation with 100-liter fermentor of both batch and fed-batch techniques at 35 ?C the ethanol yields were comparable to those achieved in laboratory scale. Fed-batch fermentation reduced fermentation time from 42 hours to 32 hours with similar final ethanol content. Repeated fed-batch fermentation in laboratory scale showed that the first batch was relatively slow in ethanol formation whereby 36 hours was needed to yield only 6.49% v/v. However, from second batch (repeat batch 1) onwards the fermentation times were reduced to 24 hours with final ethanol concentration reaching 9.36% v/v and gradually reduced to 7.13 %v/v in the last batch. The main cause of rapid fermentation was attributed to high initial cell content as can be seen from initial OD at 0.63 in the first batch and abruptly increased to 8.06, 11.51, 6.81, 9.61 และ 11.41 in the following batch. However, it should be noticed that the final ethanol concentration was lower in the succeeding batch which might be due to combine effect of high temperature and high ethanol content and accumulation of toxic substances from molasses. Therefore, double stage repeated fed-batch fermentation was introduced. In this system repeated batch was performed after 12 hours fermentation (ethanol concentration was still low) where agitation was stopped for 10 minutes to allow sedimentation of yeast cells. The upper portion of fermentation broth (2,400 ml) was then drawn out by suction leaving 600 ml fermented broth in the fermentor. Equal amounts of fresh steriled molasses medium was added and the fermentation resumed. The previous fermented broth was collected in a glass jar and allowed to continue fermentation on a magnetic stirrer for 36 hours. With the technique, final ethanol yields in the repeated batch was considerably constant at 8 %v/v after 24 hours fermentation, however at only 12 hours fermentation time the ethanol concentration was nearly maximum and fermentation could be terminated. In conclusion, Saccharomyces cerevisiae M30 is a potent strain for production of fuel alcohol under repeated fed-batch condition where fermentation time could be attained at 12 hours. Hence, the ethanol production efficiency could be achieved at 70.78 g/l/week as compared to 7.9 g/l/week normally obtained at the Chitralada Palace Alcohol Plant. For fodder yeast production with air-lift fermentor, model vessel was fabricated from a cylindrical glass jar measured 33x15 cm with 5 liters total capacity. Draught tube was made from PVC pipe 9 cm in diameter by 12 cm long. The tube was position at 2.5 cm above the bottom of glass jar. Corner of the glass jar was filled with clay in the concave manner to prevent cell accumulation. Aeration rate of the fermentor was optimal at 0.75 vvm for molasses medium containing 4% sugars, 0.1% urea and 0.05% KH2PO4 with adjusted initial pH of 4.5. After 36 hours of fermentation, 17.52 g/l of yeast dry weight was obtained, however total protein was extremely low at 3.28 g/l which was equivalent to 18.7% protein content. Increasing of initial urea content in the medium higher than 0.1% seemed inappropriate due to toxicity of ammonium ion liberated from urea. Therefore, different urea supplement feeding schemes were applied after fermentation for 12, 24 and 36 hours with the total urea addition of 0.3%. However, negative effects of urea remained where control (without additional urea) gave highest cell mass at 17.99 g/l and other treatments yielded only 12.93, 11.80 and 13.39 g/l. Modified feeding strategy was then developed (including ammonium sulfate as alternative nitrogen source). Results showed that addition of urea at 0.1% in 12 and 24 hours improved protein content of M30 to 45%. In order to increase final biomass initial sugar concentration was raised to 5.5%, but cell mass remained the same. On contrary higher initial sugar contents resulted in higher ethanol formations and residual sugar concentrations. Hence, feeding of sugar was introduced to the medium at 12 and 24 hours at the rate of 4% each together with 0.1% urea. The techniques could boost the final cell dry weight to 25.86 g/l. However, the ethanol concentration remained high at 20.6 g/l which clearly indicated that feeding pattern was not related to growth. Finally 3 feeding strategies, namely linear feeding, exponential feeding and sigmoidal feeding were developed where predetermined amounts of sugar was added at 2 hours interval (after 12 hours of fermentation). Results showed that all feeding types gave similar biomass at 32.26, 32.66 and 33.91 g/l, respectively. In addition, total protein yields were also relatively high at 16.22, 16.05 and 16.98 g/l which were equivalent to 50.3, 49.1 and 50.1 %, respectively. In pilot scale study of fodder yeast production by air-lift system, the fermentor was made of 100 liter recycled blue plastic tank and draught tube was made from fiber glass. When fermentation conditions according to laboratory experiments were applied, biomass and protein yields were similar to those obtained at laboratory scale, i.e., 30.58 g/l and 15.29 g/l, respectively. With repeated batch technique, the fermentation time could be reduced to 12 hours with cell yield at 26.59 g/l and total protein obtained at 13.83 g/l. Sub project 3 Development of a Process Utilising a Mixed Culture of Yeast and Lactic Acid Bacteria for Animal Feed Production This research focuses on the isolation of antimicrobial- producing lactic acid bacteria from cane juice and the investigation of their antagonistic effect on growth of yeast and other contaminating bacteria in the process of yeast cell production for animal feed. It was found that lactic acid bacteria isolated from cane juice exhibited antimicrobial activities against all contaminating bacteria found in cane juice and molasses. They also showed antagonistic activity against pathogenic bacteria including Staphylococcus aureus, Listeria inocua, Escherichia coli, Bacillus cereus and Salmonella anatum. In addition, they were able to inhibit growth of Saccharomyces cerevisiae SC90 but not S.cerevisiae M30. These lactic acid bacteria were characterised as Lactobacillus plantarum Lactobacillus pentosus, Lactobacillus coprophilus and Leuconostoc mesenteroides. In the fermentation studies, L. plantarum was chosen to assess its potential for use to reduce and prevent bacterial contamination in yeast cell production process. The results showed that the lactic acid bacteria and S. cerevisiae M30 coexisted and that the lactic acid bacteria had no adverse effect on maximum specific growth rate of the yeast, neither in sterile nor non-sterile cane juice based medium. It was also found that the yeast specific growth rate was not affected by the addition of contaminating bacteria at 107 cfu/ml in the culture. However, the total biomass yield maximal cell dry weight were reduced in the mixed cultures when compared with the pure yeast culture. Furthermore, it was found that the lactic acid bacteria could prevent growth of other contaminating bacteria when the non-sterile medium was used. In cyclic fed batch (CFBC) of the mixed culture, the contaminating bacteria showed their growth competition resulting in a rapid increase in the cell number from approximately 105 to 108 cfu/ ml within 24 hours. This may be due to the growth-rate limiting condition of CFBC which favoured the growth of contamination bacteria. Sub project 4 Efficiency Improvement for the Pilot Plant of Alcohol Production Production of fuel ethanol from molasses at Royal Chitralada’s project was improved from the optimization of the fermentation and distillation processes. With suitable adjustments of initial reducing sugar content and percentage of inoculum together with the control of maximum fermentation temperature and improved process procedures, ethanol concentration after 72 hours of fermentation increases from 7-8% (V/V) (from the previous procedures) to 11-12% (V/V) or 10-11% for 48 hours of fermentation. Together with the improvement of distillation process, the ethanol production increased from 640-740 litters (10000 litters of slop) per batch to 950-1100 liters (9100 litters of slop) per batch. With the reduced fermentation cycle time to 48 hours, at least 2 operation batches per week can be done incase more productivity is required. The Improved pilot plant can be used to scale up to the larger size or to demonstrate for small plants in the rural area. Waste treatment is one of the important problems in Thai distilleries. Due to the very high organic matter of yeast cell and sugar residue in the fermentation broth, treatment of the stillage is found difficult to meet the regulatory discharge limits. To reduce the amount of stillage, the preliminary studies to re-use the stillage as the replacement of fresh water for single cell protein production and ethanol production had been examined. It was found that the maximum percentage of the replacement by stillage depends on the initial total concentration of reducing sugar and the microorganism in the system. For the fermentation by Saccharomyces cerevisiae M30, it was viable to recycle of stillage to replace 30-50 % of the total fresh water requirements.

บรรณานุกรม :
สาวิตรี ลิ่มทอง . (2548). การปรับปรุงการผลิตแอลกอฮอล์ของโครงการส่วนพระองค์สวนจิตรลดา.
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย.
สาวิตรี ลิ่มทอง . 2548. "การปรับปรุงการผลิตแอลกอฮอล์ของโครงการส่วนพระองค์สวนจิตรลดา".
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย.
สาวิตรี ลิ่มทอง . "การปรับปรุงการผลิตแอลกอฮอล์ของโครงการส่วนพระองค์สวนจิตรลดา."
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย, 2548. Print.
สาวิตรี ลิ่มทอง . การปรับปรุงการผลิตแอลกอฮอล์ของโครงการส่วนพระองค์สวนจิตรลดา. กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย; 2548.