ridm@nrct.go.th   ระบบคลังข้อมูลงานวิจัยไทย   รายการโปรดที่คุณเลือกไว้

การแยกและวิเคราะห์ทางสรีรวิทยาของแบคทีเรียผ่าเหล่าที่ดื้อต่อ superoxide ใน Xanthomonas campestris pv. phaseoli ที่สูญเสียการทำงานของ oxyR เพื่อเข้าใจบทบาทของยีน oxyR ต่อการต้านทานต่อสาร superoxide

หน่วยงาน สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย

รายละเอียด

ชื่อเรื่อง : การแยกและวิเคราะห์ทางสรีรวิทยาของแบคทีเรียผ่าเหล่าที่ดื้อต่อ superoxide ใน Xanthomonas campestris pv. phaseoli ที่สูญเสียการทำงานของ oxyR เพื่อเข้าใจบทบาทของยีน oxyR ต่อการต้านทานต่อสาร superoxide
นักวิจัย : ไพบูลย์ วัฒนวิบูลย์
คำค้น : ahpCF , menadione , OxyR , superoxide , Xanthomonas
หน่วยงาน : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย
ผู้ร่วมงาน : -
ปีพิมพ์ : 2545
อ้างอิง : http://elibrary.trf.or.th/project_content.asp?PJID=PDF4380065 , http://research.trf.or.th/node/675
ที่มา : -
ความเชี่ยวชาญ : -
ความสัมพันธ์ : -
ขอบเขตของเนื้อหา : -
บทคัดย่อ/คำอธิบาย :

คณะผู้วิจัยได้ทำการศึกษาในแบคทีเรียXanthomonas campestris pv. phaseoli ที่สูญเสีย การทำงานของยีน oxyR (คือ Xp oxyR) พบว่าแบคทีเรียมีความไวต่อสารที่สร้างsuperoxide โดย เฉพาะอย่างยิ่ง menadione เพื่อที่จะหาว่ามีเอนไซม์ที่เกี่ยวข้องกับการทำลายสารเปอรอกไซด์ตัว ใดที่ช่วยให้แบคทีเรียต้านทานต่อสาร menadione ดังนั้นคณะผู้วิจัยจึงทำการ clone ยีน Catalase (KatA), alkyl hydroperoxide reductase (AhpCF), Superoxide dismutase (SOD) และ organic hydroperoxide resistance (Ohr) จากแบคทีเรีย X. campestris pv. phaseoli เข้าสู่ expression plasmid vector แล้วถ่ายเข้า Xp oxyR จากผลการทดสอบความไวต่อสาร menadione พบว่าการเพิ่มการแสดงออกฃอง ahpCF สามารถเพิ่มความต้านทานต่อ menadione ใน Xp oxyR ได้กลับมาเท่ากับระดับของ wild type ในขณะที่ SOD สามารถเพิ่มความต้านทาน ได้เพียงเล็กน้อย ส่วนเอ็นไซม์อื่นๆ ไม่มีผลต่อความต้านทานต่อ menadione ต่อมาคณะผู้วิจัย ได้ทำการคัดเลือกแบคทีเรียกลายพันธ์ จาก Xp oxyR ที่สามารถเจริญได้บนอาหารเลี้ยงเชื่อที่มี menadione เพื่อศึกษาว่ามีกลไกอื่นที่แบคทีเรียใช้ในการทำลายพิษของ menadione จากการคัด เลือกได้สายพันธ์ที่ให้ชื่อว่า oxyR R2 ที่มีระดับการต้านทานต่อ menadione เกือบเท่ากับ wild type จากการวิเคราะห์ระดับของเอนไซม์ที่เกี่ยวข้องต่างๆพบว่าระดับของ Catalase, SOD และ Ohr มีระดับที่ไม่แตกต่างจาก Xp oxyR แต่ระดับของ AhpCF เพิ่มขึ้นอย่างมาก จากผลการวิจัย แสดงให้เห็นว่า alkyl hydroperoxide reductase มีบทบาทสำคัญเป็นอย่างยิ่งในการป้องกันพิษ จาก menadione เนื่องจากการแสดงออกของทั้ง ahpC และ ahpF อยู่ภายใต้การควบคุมของ oxyR ดังนั้น oxyR จึงเกี่ยวข้องกับการป้องกันพิษจาก menadione โดยผ่านการทำงานของ ahpCF เพื่อยืนยันว่า ahpCF มีบทบาทจริงคณะผู้วิจัยจึงทำการ knock-out การทำงานของยีน ahpC ใน oxyR R2 โดยวิธี insertional inactivation พบว่า oxyR R2 ที่สูญเสียการทำงานของยีน ahpC มีความไวต่อ menadione ใกล้เคียงกับใน Xp oxyR ต่อมาเพื่อหาว่า mutation ที่เกิดขึ้นใน oxyR R2 เกิดขึ้นที่ใดจึงทำให้ระดับของ AhpCF เพิ่มขึ้น คณะผู้วิจัยจึงทำการวิเคราะห์บริเวณโปร โมเตอร์ที่ควบคุมการแสดงออกของยีน ahpC โดยหาลำดับเบสใน oxyR R2 และสายพันธ์ที่ต้าน menadione อื่นๆ พบว่ามี mutation เกิดขึ้นสองบริเวณคือ มีการเพิ่มเบส G บริเวณที่เป็น ตำแหน่งเกาะของโปรตีน OxyR และมี mutation ที่บริเวณ -35 region ดังนั้นจึงเป็นไปได้ว่า mutation ที่เกิดขึ้นส่งผลให้การเกาะของ sigma factor เกิดขึ้นได้ดีจึงทำให้เกิดการ transcription ของ ahpCF โดยไม่ต้องอาศัยการทำงานของ OxyR นอกจากนี้คณะผู้วิจัยยังได้ทำการศึกษา การทำงานของ alkyl hydroperoxide reductase ในด้านการป้องกันพิษจากสาร organic hydroperoxide พบว่าในแบคทีเรีย X. campestris pv. phaseoli ต้องการการทำงานร่วมกันของ เอนไซม์สองประเภทคือ AhpCF และ Ohr จึงสามารถป้องกันพิษได้สมบูรณ์ Xanthomonas campestris pv. phaseoli oxyR mutant (Xp oxyR) was dramatically increased sensitivity to killing by menadione, a redox cycling compound that generated superoxide radicals. In order to understading the role of peroxide scavenging enzymes on menadione toxicity protection of X. campestris pv. phaseoli, catalase (KatA), alkyl hydroperoxide reductase (AhpCF), superoxide dismutase (SOD), organic hydroperoxide resistance (Ohr), were cloned into expression plasmid vectors and transferred into Xp oxyR. High expression of cloned ahpCF in X. campestris pv. phaseoli oxyR was able to complement the menadione hypersensitivity phenotype but high level of other peroxide scavenging enzymes i.e. catalase, SOD and organic hydroperoxide resistance (Ohr) could not compensate that phenotype. The mutations suppressed menadione hypersensitivity of X. campestris pv. phaseoli oxyR were selected by plating stationary phase cultures on medium containing menadione. The hypersensitivity to menadione and plumbagin killing in a suppressor mutant named oxyRR2 was suppressed almost to wild type level while the level of H2O2 resistance was moderately decreased. The suppression was not due to elevation of total superoxide dismutase (SOD) activity. The sensitive phenotype to H2O2 and tert-butyl hydroperoxide (tBOOH) of oxyRR2 was partially suppressed. The level of catalase in mutant oxyRR2 was not significantly different from its parental strain X. campestris pv. phaseoli oxyR. Interestingly, the level of AhpC and AhpF subunits of alkylhydroperoxide reductase was increased by several folds. All other suppressor mutants were also characterized and showed similar profile as XpR2. An ahpC knock-out mutant of oxyRR2 was constructed and this mutant showed increased sensitivity to menadione as seen in its X. campestris pv. phaseoli oxyR parental strain. These data strongly suggested that alkyl hydroperoxide reductase has an important function on detoxicification of menadion in X. campestris. The promoter region of ahpC was characterized and the nucleotide sequences both in wild type and oxyRR2 were determined. The results revealed mutations in the promoter region of oxyRR2 and these mutations might facilitate binding of sigma factor and lead to increased expression of ahpCF in an OxyR-independent manner. Additionally, the role AhpCF in protection against organic peroxide was evaluated. The results showed that X. campestris pv. phaseoli required both AhpCF and Ohr to fully protect cells from organic peroxide toxicity.

บรรณานุกรม :
ไพบูลย์ วัฒนวิบูลย์ . (2545). การแยกและวิเคราะห์ทางสรีรวิทยาของแบคทีเรียผ่าเหล่าที่ดื้อต่อ superoxide ใน Xanthomonas campestris pv. phaseoli ที่สูญเสียการทำงานของ oxyR เพื่อเข้าใจบทบาทของยีน oxyR ต่อการต้านทานต่อสาร superoxide.
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย.
ไพบูลย์ วัฒนวิบูลย์ . 2545. "การแยกและวิเคราะห์ทางสรีรวิทยาของแบคทีเรียผ่าเหล่าที่ดื้อต่อ superoxide ใน Xanthomonas campestris pv. phaseoli ที่สูญเสียการทำงานของ oxyR เพื่อเข้าใจบทบาทของยีน oxyR ต่อการต้านทานต่อสาร superoxide".
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย.
ไพบูลย์ วัฒนวิบูลย์ . "การแยกและวิเคราะห์ทางสรีรวิทยาของแบคทีเรียผ่าเหล่าที่ดื้อต่อ superoxide ใน Xanthomonas campestris pv. phaseoli ที่สูญเสียการทำงานของ oxyR เพื่อเข้าใจบทบาทของยีน oxyR ต่อการต้านทานต่อสาร superoxide."
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย, 2545. Print.
ไพบูลย์ วัฒนวิบูลย์ . การแยกและวิเคราะห์ทางสรีรวิทยาของแบคทีเรียผ่าเหล่าที่ดื้อต่อ superoxide ใน Xanthomonas campestris pv. phaseoli ที่สูญเสียการทำงานของ oxyR เพื่อเข้าใจบทบาทของยีน oxyR ต่อการต้านทานต่อสาร superoxide. กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย; 2545.