ridm@nrct.go.th   ระบบคลังข้อมูลงานวิจัยไทย   รายการโปรดที่คุณเลือกไว้

การโคลนและการศึกษาการแสดงออกของชิ้น cDNA ที่สร้างโปรตีนในกลุ่มเดียวกับ molt inhibiting hormone จากกุ้งกุลาดำ (Panaeus monodon)

หน่วยงาน สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย

รายละเอียด

ชื่อเรื่อง : การโคลนและการศึกษาการแสดงออกของชิ้น cDNA ที่สร้างโปรตีนในกลุ่มเดียวกับ molt inhibiting hormone จากกุ้งกุลาดำ (Panaeus monodon)
นักวิจัย : อภินันท์ อุดมกิจ
คำค้น : cDNA , molt-inhibiting hormone , Penaeus monodon , กุ้งกุลาดำ
หน่วยงาน : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย
ผู้ร่วมงาน : -
ปีพิมพ์ : 2543
อ้างอิง : http://elibrary.trf.or.th/project_content.asp?PJID=PDF4080060 , http://research.trf.or.th/node/529
ที่มา : -
ความเชี่ยวชาญ : -
ความสัมพันธ์ : -
ขอบเขตของเนื้อหา : -
บทคัดย่อ/คำอธิบาย :

วัตถุประสงค์ของการวิจัยนี้คือ โคลนและศึกษาลักษณะของ cDNA ที่สร้างฮอร์โมนใน กลุ่มเดียวกับ molt- inhibiting hormone (Pem-CMG) จาก กุ้งกุลาดำ และทำการแสดงออกของ เปปไทด์ Pem-CMG จาก cDNA ที่โคลนได้ใน Escherichia coli โดยใช้เทคนิค Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE) ในการโคลนชิ้น cDNA และทำการแสดงออกของชิ้น cDNA ใน E. coli โดยใข้ pET3a เป็น expression vector หลังจากนั้นจึงทำการละลาย และแยกบริสุทธิ์ โปรตีนโดย reverse-phase HPLC ผลจากการโคลนชิ้น cDNA สำหรับเปปไทด์ 3 ชนิดคือ Pem-CMG1 Pem-CMG2 และ Pem-CMG3 ลำดับกรดอะมิโนที่ถอดรหัสจากลำดับนิวคลีโอไทด์ของ cDNA ทั้ง 3 ชนิด ในส่วนของ mature peptide มีความคล้ายคลึงกันมากกว่า 93% การแสดงออกของชิ้น cDNA ส่วนที่เก็บรหัสทั้ง สายและส่วนที่เก็บรหัสเฉพาะ mature peptide สำหรับ Pem-CMG1 พบว่าให้โปรตีนที่อยู่ในรูปของ inclusion เมื่อตรวจสอบลำดับกรดอะมิโนทางปลาย N ของโปรตีนที่แสดงออกจากชิ้น cDNA ทั้ง สองพบว่ามีลำดับกรดอะมิโนตรงกับที่ถอดรหัสได้จากลำดับนิวคลีโอไทด์ของ cDNA โปรตีนที่แสดง ออกจาก cDNA ในส่วนที่เก็บรหัสเฉพาะ mature peptide ของ Pem-CMG1 สามารถละลายได้ใน 6M urea การแยกบริสุทธิ์ของโปรตีนโดยใช้ JUPITER 5u C18 column (250 x 6.6 mm, Phenomenex) สามารถกำจัดโปรตีนที่ปนเปื้อนส่วนใหญ่ออกได้ ชิ้น cDNA สำหรับเปปไทด์ 3 ชนิดคือ Pem-CMG1 Pem-CMG2 และPem-CMG3 ที่โคลน ได้จากงานวิจัยนี้ สามารถถอดรหัสเป็นลำดับกรดอะมิโนที่มีความคล้ายคลึงและมีลักษณะที่สำคัญ ของฮอร์โมนในกลุ่ม CHH/MIH/GIH โปรตีนที่แสดงออกจาก cDNA ของ Pem-CMG1 อยู่ในรูปของ inclusion ซึ่งต้องผ่านขั้นตอนในการละลายและการทำ refolding เพื่อให้ได้โปรตีนที่อยู่ใน conformation ที่ถูกต้องและทำหน้าที่ได้ การแยกบริสุทธิ์โดย reverse-phase HPLC เพียงหนึ่งขั้น ตอนในการทดลองนี้สามารถกำจัดโปรตีนที่ปนเปื้อนส่วนใหญ่ออกไปได้ อย่างไรก็ตามโปรตีนที่ได้ มาอาจจะต้องผ่านขั้นตอนการแยกบริสุทธิ์เพิ่มขึ้นเพื่อให้ได้โปรตีนที่มีความบริสุทธิ์เพียงพอสำหรับ นำไปใช้ทดสอบหน้าที่ของโปรตีนนั้น ข้อเสนอแนะ: เปปไทด์ Pem-CMG1 ที่แสดงออกใน E. coli ต้องผ่านกระบวนการต่างๆเช่น การ ละลาย การทำ refolding และการแยกบริสุทธิ์อีกหลายขั้นตอน เพื่อให้ได้โปรตีนที่มีความบริสุทธิ์ เพียงพอและอยู่ใน conformation ที่เหมาะสมสำหรับการนำไปทดสอบหน้าที่ การแสดงออกของ Pem-CMG1 ใน expression system ของ eukaryote เช่น yeast จะช่วยให้โปรตีนที่มีการ fold อยู่ ใน conformation ที่เหมาะสม และเมื่อใช้ expression system ที่มีการหลั่งโปรตีนที่แสดงออก ออก มานอกเซลล์ ก็จะช่วยลดขั้นตอนในการแยกบริสุทธิ์ให้น้อยลงอีกด้วย Objectives : 1. To clone and characterize cDNAs that encode molt-inhibiting hormone related peptides (Pem-CMG peptides) from Penaeus monodon. 2. To express the Pem-CMG peptide from the cloned cDNA in Escherichia coli. Methodology : cDNAs encoding Pem-CMG peptides were cloned from P. monodon’s eyestalk RNA using Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE) strategy. The coding region for Pem-CMG1 peptide was subcloned into pET3a expression vector, and expressed in Escherichia coli. The expressed product was solubilized and was purified by reversed phase HPLC. Results : Three cDNAs coding for Pem-CMG1, Pem-CMG2 and Pem-CMG3 peptides were cloned. The translated amino acid sequences in the mature peptide region of the three Pem-CMG peptides were more than 93% identical. A coding sequence for the full- length and the mature peptide region of Pem-CMG1 were expressed in E. coli. The amino acid sequence at the N-terminal of expressed peptides were determined and confirmed that they were expressed from Pem-CMG cDNA. The expressed products occurred as insoluble inclusion body. This inclusion could be solubilized with more than 50% solubitlity in 6M urea. The expressed Pem-CMG1 peptide was partially purified. After a single round of reverse phase HPLC using JUPITER 5u C18 column (250 x 6.6 mm, Phenomenex), most of the contaminated proteins were removed. Discussion / Conclusion : The cDNAs encoding peptide hormones in CHH/MIH/GIH family, so-called Pem-CMG peptides, were successfully cloned from P. monodon. The translated amino acid sequences from Pem-CMG1, Pem-CMG2 and Pem-CMG3 cDNA revealed that they were highly similar and possessed all characteristics of other peptides in the same family previously characterized in several crustacea. Since Pem-CMG1 peptide was expressed in E. coli as insoluble inclusion body, appropriate solubilization and refolding methods would be needed in order for the Pem-CMG1 peptide to be in biologically active conformation. Single step purification of solubilized Pem-CMG1 peptide could get rid of most of the contaminated proteins. However, further purification steps should be conducted so as to get the Pem-CMG1 peptide with higher purity. The purified Pem-CMG1 protein could then be used in biological activity assay in order to determined the function of this peptide. Suggestions / Further Implication / Implementation : The Pem-CMG1 peptide expressed in E. coli needs several downstream processes for solubilization, refolding and purification before the assay for biological activity of the peptide could be done. Using expression system in eukaryotes such as yeast may help the expressed peptide to fold in the conformation that is appropriate for its function. The use of secretion expression system would also help improve both the yield and the purity of the expression product.

บรรณานุกรม :
อภินันท์ อุดมกิจ . (2543). การโคลนและการศึกษาการแสดงออกของชิ้น cDNA ที่สร้างโปรตีนในกลุ่มเดียวกับ molt inhibiting hormone จากกุ้งกุลาดำ (Panaeus monodon).
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย.
อภินันท์ อุดมกิจ . 2543. "การโคลนและการศึกษาการแสดงออกของชิ้น cDNA ที่สร้างโปรตีนในกลุ่มเดียวกับ molt inhibiting hormone จากกุ้งกุลาดำ (Panaeus monodon)".
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย.
อภินันท์ อุดมกิจ . "การโคลนและการศึกษาการแสดงออกของชิ้น cDNA ที่สร้างโปรตีนในกลุ่มเดียวกับ molt inhibiting hormone จากกุ้งกุลาดำ (Panaeus monodon)."
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย, 2543. Print.
อภินันท์ อุดมกิจ . การโคลนและการศึกษาการแสดงออกของชิ้น cDNA ที่สร้างโปรตีนในกลุ่มเดียวกับ molt inhibiting hormone จากกุ้งกุลาดำ (Panaeus monodon). กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย; 2543.