ridm@nrct.go.th   ระบบคลังข้อมูลงานวิจัยไทย   รายการโปรดที่คุณเลือกไว้

การหาวิธีที่เหมาะสมในการวัดความสามารถในการทำงานของ เอ็นไซม์โบรโมเปอร์ออกซิเดสเพื่อการประยุกต์ใช้ทางด้าน เทคโนโลยีชีวภาพ

หน่วยงาน ฐานข้อมูลวิทยานิพนธ์ไทย

รายละเอียด

ชื่อเรื่อง : การหาวิธีที่เหมาะสมในการวัดความสามารถในการทำงานของ เอ็นไซม์โบรโมเปอร์ออกซิเดสเพื่อการประยุกต์ใช้ทางด้าน เทคโนโลยีชีวภาพ
นักวิจัย : รัชนีพร เจนวิถีสุข
คำค้น : -
หน่วยงาน : ฐานข้อมูลวิทยานิพนธ์ไทย
ผู้ร่วมงาน : -
ปีพิมพ์ : 2539
อ้างอิง : http://www.thaithesis.org/detail.php?id=41745
ที่มา : -
ความเชี่ยวชาญ : -
ความสัมพันธ์ : -
ขอบเขตของเนื้อหา : -
บทคัดย่อ/คำอธิบาย :

Bromoperoxidase, the haloperoxidase enzyme that catalyzes the peroxidative bromination of many organic substrates in the presence of hydrogen peroxide. The problem with assay of bromoperoxidase activity is the lack of a good substrate. The traditional haloperoxidase substrate, namely monochlorodimedone (MCD), has no color and produces colorless product which can be detected with difficulty. Phenol red is a good substrate in terms of being easily detectable by observation the color change visually or measuring the increase in absorbance at 590 nm. However, in bromination of phenol red, the product is actually a mixture containing some mono-, di-, tri and tetrabrominated phenol red derivatives and the enzyme kinetics can not be determined correctly. In this study, we therefore propose that a substrate with three chlorine atoms on phenol red may be an appropriate substrate for bromoperoxidase, since only a single site can be brominated. Dichlorophenol red was chlorinated to give tri- and tetrachlorinated phenol red by using chloroperoxidase (CPO). In the CPO- catalyzed reaction, the yellow color of dichlorophenol red(...)(,max)430 nm) changed to the light brown chlorinated product (...)(max) 575 nm). When the reaction mixture was analyzed by HPLC, three peaks appeared, i.e., peak I (RT 1.87 min), peak II (RT 2.21 min) and peak III (RT 2.42 min) which were tetra-, di- and trichlorophenol red, respectively. The chlorinated products of dichlorophenol red could be separated on TLC plates, using amyl alcohol-ethanol-conc. NH(,4)0H (50:45:5) as mobile phase. The R(,f) values of di-, tri- and tetrachlorophenol red were 0.35, 0.40 and 0.42, respectively. Dichlorophenol red and its chlorinated products were separated by DEAE-cellulose column chromatography. Three peaks, peak A, peak B and peak C, were obtained. Peak A (yellow color with (...)(max) 435 nm), peak B (light brown color with (...) (,max) 445 nm and 580 nm) and peak C (blue color with (...)(max) 590 nm) were di-, tri and tetrachlorophenol red, respectively. The pKa values of di-, tri- and tetrachlorophenol red were determined by titration technique to be 5.7 - 6.0, 4.4 - 4.6 and 3.9 - 4.1, respectively. Trichlorophenol red was used as substrate for assaying bromoperoxidase in comparison with phenol red and dichlorophenol red. The color-changed after bromination of trichlorophenol red, dichlorophenol red and phenol red appeared at 2, 5 and 10 min after the reaction was started. Determination of Km values for bromoperoxidase of phenol red, dichlorophenol red and trichlorophenol red showed that Km of trichlorophenol red (2.23 x 10(-5) M) was 3 times higher than that of phenol red (8.02 x 10(-6) M) and 4 times higher than that of dichlorophenol red (5.75x10(-6) M). In addition, the lag time observed in bromoperoxidase assay was almost insignificance when trichlorophenol red was used as substrate when compared to phenol red substrate

however, the lag time observed in dichlorophenol red is a little bit higher than that of trichlorophenol red. The purple-colored trichlorophenol red gave blue-colored product upon bromination with BPO which have advantage over MCD which produced colorless product. Moreover, the lag time observed in bromoperoxidase assay with trichlorophenol red substrate was less than that observed with MCD substrate. ..ABT โบรโมเปอร์ออกซิเดส เป็นเอ็นไซม์ในกลุ่มเฮโลเปอร์ ออกซิเดสที่สามารถเร่งปฏิกริยาออกซิเดทีฟโบรมิเนชั่นกับ สับสเตรทได้หลายชนิด เมื่อมีไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ เอ็นไซม์ นี้ก็มีปัญหาในการตรวจวัดโบรโมเปอร์ออกซิเดสแอกติวิตี คือ ขาดสับสเตรทที่มีคุณสมบัติที่ดีสำหรับใช้ตรวจวัดแอกติวิตี MCD เป็นสับสเตรทที่นิยมใช้กันมานานก็มีข้อเสีย คือ เป็น สารไม่มีสี และเมื่อทำปฏิกริยากับเอ็นไซม์ก็ให้ผลผลิตที่ไม่ มีสีเช่นเดียวกัน ซึ่งทำให้เกิดความยุ่งยากในการตรวจวัด โบรโมเปอร์ออกซิเดสแอกติวิตี ต่อมา phenol red ได้ ถูกนำมาใช้เป็นสับสเตรท ซึ่งมีข้อดี คือ เป็นสารมีสี และ เมื่อทำปฏิกริยากับเอ็นไซม์จะสามารถสังเกตเห็นการเปลี่ยนแปลง ของสีระหว่างสับสเตรทกับผลิตผลได้ด้วยตาเปล่า ซึ่งเป็นวิธีการ ตรวจวัดที่ง่ายและสะดวก แต่อย่างไรก็ตาม phenol red ก็มี ข้อเสีย คือ ในการเกิดปฏิกริยาโบรมิเนชั่นของ phenol red นั้น จะให้สารผลิตผลที่เป็นอนุพันธ์ของ phenol red 4 ชนิด ปะปนกัน ซึ่งทำให้ไม่สามารถนำไปใช้ในการศึกษาจลนศาสตร์ ของเอ็นไซม์ได้ ดังนั้นสับสเตรทที่มีคลอรีนอะตอม 3 อะตอม บน phenol red น่าจะเป็นสับสเตรทที่เหมาะสมสำหรับ โบรโมเปอร์ออกซิเดส เพราะว่ามีตำแหน่งสำหรับโบรมิเนชั่น เพียงตำแหน่งเดียว ดังนั้นในรายงานนี้ Trichlorophenolred ได้ถูก สังเคราะห์ขึ้นจาก dichloro-phenol red โดยใช้เอ็นไซม์ คลอโรเปอร์ออกซิเดส ในการเกิดปฏิกริยาเมื่อใช้ คลอโร- เปอร์ออกซิเดสเป็นตัวเร่งปฏิกริยาจะมีการเปลี่ยนแปลงของสี จากสีเหลืองของ dichlorophenol red ((...)(,max) 430 nm) เป็นสีน้ำตาลอ่อนของสารผลิตผล ((...)(,max) 575 mm) จาก การวิเคราะห์สารผลิตผลที่เกิดขึ้นโดย HPLC พบว่าผลิตผลที่ได้ จากการสังเคราะห์มี 2 ตัว คือ Trichlorophenol red และ tetrachlorophenol red ที่ retention time 2.42 นาที (peak III) และ 1.87 นาที (peak I) และ สับสเตรท dichlorophenol red ที่ retention time 2.21 นาที (peak II) TLC สามารถแยกสารผลิตผลเหล่านี้ โดยใช้ amyl alcohol-ethanol-conc. NH(,4)OH (50:45:5) เป็น mobile phase ค่า R(,f) ของ di-, tri- และ tetrachlorophenol red เท่ากับ 0.35, 0.40 และ 0.42 ตามลำดับ สารเหล่านี้ สามารถทำการแยกได้โดยวิธีโครมาโตกราฟฟีคอลัมน์ชนิด DEAE- cellulose ซึ่งสามารถแยกออกได้ 3 ชนิด คือ dichloropheno red (สีเหลือง, (...)(,max) 435 nm), trichlorophenol red (สีน้ำตาลอ่อน, (...)(,max) 445 nm และ 580 nm) และ tetrachlorophenol red (สีฟ้า, (...)(max) 590 nm) จากการหาค่า pKa โดยวิธีไตเตรท พบว่า ค่า pKa ของ di-, tri- และ tetrachlorophenol red เท่ากับ 5.7-6.0, 4.4-4.6 และ 3.9-4.1 ตามลำดับ trichlorophenol red ได้ถูกนำมาใช้เป็นสับสเตรทสำหรับโบรโมเปอร์ออกซิเดส โดย เปรียบเทียบกับ phenol red และ dichlorophenol red ในการเกิดปฏิกริยาโบรมิเนชั่นพบว่า trichlorophenol red ให้การเปลี่ยนแปลงของสีเกิดขึ้นเร็วที่สุด เร็วกว่า dichlorophenol red 3 เท่า และเร็วกว่า phenol red 5 เท่า และพบว่า trichlorophenol red มี lag time น้อยที่สุดเมื่อเทียบกับ dichlorophenol red และ phenol red ค่า Km ของ trichlorophenol red สำหรับเอ็นไซม์โบรโมเปอร์ออกซิเดส (2.23x10(-5) M) สูงกว่าค่า Km ของ phenol red (8.02x10(-6) M) 3 เท่า และสูงกว่าค่า Km ของ dichlorophenol red (5.75x10(-6) M) 4 เท่า นอกจากนี้ trichlorophenol red เป็นสับสเตรทที่ดีกว่า เมื่อเปรียบเทียบกับ MCD เมื่อนำไปใช้ศึกษาจลนศาสตร์ของ เอ็นไซม์ เนื่องจากการเกิดปฏิกริยาโบรมิเนชั่นของ trichlorophenol red สามารถสังเกตเห็นการเปลี่ยนแปลง ของสีได้ด้วยตาเปล่าและสามารถวัดได้ง่ายในเครื่องสเปคโตรโฟโต มิเตอร์ที่ความยาวคลื่นในช่วงที่ตามองเห็นได้ และมี lag time น้อยกว่า MCD

บรรณานุกรม :
รัชนีพร เจนวิถีสุข . (2539). การหาวิธีที่เหมาะสมในการวัดความสามารถในการทำงานของ เอ็นไซม์โบรโมเปอร์ออกซิเดสเพื่อการประยุกต์ใช้ทางด้าน เทคโนโลยีชีวภาพ.
    กรุงเทพมหานคร : ฐานข้อมูลวิทยานิพนธ์ไทย.
รัชนีพร เจนวิถีสุข . 2539. "การหาวิธีที่เหมาะสมในการวัดความสามารถในการทำงานของ เอ็นไซม์โบรโมเปอร์ออกซิเดสเพื่อการประยุกต์ใช้ทางด้าน เทคโนโลยีชีวภาพ".
    กรุงเทพมหานคร : ฐานข้อมูลวิทยานิพนธ์ไทย.
รัชนีพร เจนวิถีสุข . "การหาวิธีที่เหมาะสมในการวัดความสามารถในการทำงานของ เอ็นไซม์โบรโมเปอร์ออกซิเดสเพื่อการประยุกต์ใช้ทางด้าน เทคโนโลยีชีวภาพ."
    กรุงเทพมหานคร : ฐานข้อมูลวิทยานิพนธ์ไทย, 2539. Print.
รัชนีพร เจนวิถีสุข . การหาวิธีที่เหมาะสมในการวัดความสามารถในการทำงานของ เอ็นไซม์โบรโมเปอร์ออกซิเดสเพื่อการประยุกต์ใช้ทางด้าน เทคโนโลยีชีวภาพ. กรุงเทพมหานคร : ฐานข้อมูลวิทยานิพนธ์ไทย; 2539.