วิทยานิพนธ์ (วท.ม.)--จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย, 2553

งานวิจัยนี้ได้โคลนยีนแลกเคสจากรา Agrocybe sp. CU43 เพื่อให้มีการแสดงออกในเซลล์เจ้าบ้าน E. coli โดยเลี้ยงราในภาวะที่มีการเติมฟลูออรีน 500 ppm จากนั้นสกัด total RNA จากเส้นใยรา ในวันที่ 21 ซึ่งมีแอกติวิตีของแลกเคสเท่ากับ 111.11 ยูนิตต่อมิลลิลิตร แล้วสร้าง cDNA สายแรก และนำมาใช้เพิ่มจำนวนยีนแลกเคสจาก cDNA โดยปฎิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสด้วยคู่โอลิโกนิวคลีโอไทด์ไพร์เมอร์ lacC-F1 และ lacC-R5 ผลิตภัณฑ์ที่ได้มีขนาด 1,584 bp ได้รับการโคลนเข้าเวกเตอร์ pGEM®-T easy vector และตั้งชื่อรีคอมบิแนนท์พลาสมิดว่า pTTLC จากนั้นใช้ pTTLC เป็นแม่แบบในการเพิ่มจำนวนยีนแลกเคสที่มีและไม่มี signal sequence จากรา แล้วโคลนเข้าสู่เวกเตอร์ pET2126_4 เพื่อให้มีการแสดงออกใน E. coli Rosetta-Gami B (DE3) pLysS โดยแลกเคสอยู่ภายใต้การควบคุมของ T7 promoter และปลาย 5’ เชื่อมต่อหลัง pelB coding sequence และปลาย 3’ เชื่อมต่อเข้ากับ His Tag coding sequence เมื่อทดสอบบนอาหารแข็ง LB ที่มีกัวเอคอลเป็นสับสเตรตพบว่าแลกเคสไม่สามารถออกซิไดซ์สับสเตรตได้ เมื่อเลี้ยงทรานสฟอร์แมนต์ในอาหารเหลว LB ที่ใส่ IPTG ชักนำให้เกิดการแสดงออกของรีคอมบิแนนท์แลกเคส เมื่อนำไปตรวจสอบการแสดงออกด้วย SDS PAGE พบว่าทรานสฟอร์แมนต์ที่ได้รับรีคอมบิแนนท์พลาสมิดที่มียีนแลกเคสที่ไม่มี signal sequence จากราแทรกอยู่มีแถบโปรตีนขนาดประมาณ 55 KDa เกิดขึ้น และแสดงออกในรูปแบบ insoluble เนื่องจากสามารถสกัดได้ภายใต้ภาวะ denature เท่านั้น ภาวะที่เหมาะสมต่อการผลิตรีคอมบิแนนท์แลกเคสมากที่สุดคือ บ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส ความเข้มข้น IPTG 400 ไมโครโมลาร์ เป็นเวลา 3 ชั่วโมง เมื่อนำไปทำบริสุทธิ์ด้วยวิธี affinity column chromatography แล้วนำไปผ่านกระบวนการ refolding พบว่าเอนไซม์มีปริมาณเท่ากับ 228.51 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร และเมื่อนำไปทดสอบแอกติวิตีพบว่าเอนไซม์ไม่สามารถออกซิไดส์ ABTS และไม่สามารถย่อยสลายฟลูออรีนได้