ridm@nrct.go.th   ระบบคลังข้อมูลงานวิจัยไทย   รายการโปรดที่คุณเลือกไว้

การศึกษาเปปไทด์ที่มีฤทธิ์ต้านเชื้อแบคทีเรียในเลือดจระเข้สายพันธุ์ไทย (Crocodylus siamensis)

หน่วยงาน สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย

รายละเอียด

ชื่อเรื่อง : การศึกษาเปปไทด์ที่มีฤทธิ์ต้านเชื้อแบคทีเรียในเลือดจระเข้สายพันธุ์ไทย (Crocodylus siamensis)
นักวิจัย : สมปอง ธรรมศิริรักษ์
คำค้น : จระเข้ , สัตว์เลื้อยคลาน , สารออกฤทธิ์ต้านเชื้อแบคทีเรีย , โปรตีนและเปปไทด์ที่มีฤทธิ์ต้านเชื้อแบคทีเรีย
หน่วยงาน : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย
ผู้ร่วมงาน : -
ปีพิมพ์ : 2553
อ้างอิง : http://elibrary.trf.or.th/project_content.asp?PJID=RMU4980014 , http://research.trf.or.th/node/5304
ที่มา : -
ความเชี่ยวชาญ : -
ความสัมพันธ์ : -
ขอบเขตของเนื้อหา : -
บทคัดย่อ/คำอธิบาย :

การที่แบคทีเรียมีการดื้อต่อยาปฏิชีวนะที่ใช้อยู่ในปัจจุบัน กำลังเป็นปัญหาด้านสาธารณสุขมากขึ้นเรื่อยๆ เพื่อหลีกเลี่ยงปัญหาดังกล่าว นักวิทยาศาสตร์จึงต้องหาสารทำลายเชื้อแบคทีเรียชนิดใหม่ๆ จระเข้เป็นสัตว์ที่มักจะเกิดบาดเจ็บได้ง่าย แม้ว่าจระเข้จะอาศัยอยู่ในแหล่งที่อุดมด้วยจุลชีพก่อโรค แต่แผลของจระเข้กลับหายได้อย่างรวดเร็วและแทบไม่มีการติดเชื้อ ในการศึกษานี้ได้แยกบริสุทธิ์สารที่มีฤทธิ์ต้านเชื้อแบคทีเรียจากเลือดจระเข้สายพันธุ์ไทย (Crocodylus siamensis) โดยแยกสารจากส่วนซีรัม พลาสมา และสารสกัดเม็ดเลือดขาวของจระเข้ด้วยเทคนิคคอลัมน์โครมาโตรกราฟฟี จากนั้นศึกษาโครงสร้างหน้าที่และกลไกการทำลายเชื้อแบคทีเรียของสารที่แยกได้โดยจะแยกกล่าวที่ละส่วน ในส่วนซีรัมจระเข้ได้ใช้เทคนิคคอลัมน์โครมาโตรกราฟฟีชนิดแลกเปลี่ยนประจุลบ เจลฟิวเตรชั่น และ reverse phase -HPLC แยกสารที่มีฤทธิ์ทำลายเชื้อได้จำนวนทั้งสิ้น 6 ชนิด คือ p14.1, p15.9, p17.9, p31.0, p36.1 และ p51.2 ซึ่งมีความสามารถทำลายเชื้อแบคทีเรียทั้งแกรมบวกและแกรมลบ ผลการวิเคราะห์ด้วยวิธี mass spectrometry พบว่า p14.1, p15.9 และp51.1 มีขนาดเล็กกว่า 1 กิโลดาลตัน โดยสารที่แยกได้กลุ่มนี้มีค่า MIC ประมาณ 15.46μg/ml and 33.97 μg/ml จากการศึกษากลไกการทำลายเชื้อของสารที่แยกโดย SEM พบว่าเมมเบรนของแบคทีเรียน่าจะ target ในการทำลายเชื้อแบคทีเรีย ในส่วนของพลาสมาได้ทำการแยกบริสุทธิ์สารทำลายเชื้อแบคทีเรีย (Crocosin) ของเลือดจระเข้ โดยวิธีการแยกด้วยเมมเบรนแยกขนาด วิธี reverse phase-HPLC และคอลัมน์ HypercarbTM พบว่า Crocosin สามารถทำลายเชื้อแบคทีเรีย Salmonella typhi และ Staphylococcus aureus จากการวิเคราะห์โครงสร้างของ Crocosin โดยการหาลำดับกรดอะมิโนทางด้านปลายหมู่อะมิโน พบว่า Crocosin มีลำดับกรดอะมิโน 2 ตัวแรกเป็น อะลานีน และไกลซีน และจากการวิเคราะห์โดยวิธี ESI-MS/MS พบลักษณะการซ้ำๆของสเปกตราของมวล ขนาด 94 และ 136 ดาลตัล ซึ่งมวลดังกล่าวไม่สอดคล้องกับมวลของกรดอะมิโนตัวใด และ Crocosin สามารถทต่อความร้อนและทนต่อการย่อยของเอนไซม์โปรเนส ผลการทดลองดังกล่าวชี้ให้เห็นว่า Crocosin อาจไม่ใช่เปปไทด์ แต่อาจเป็นอนุพันธ์ของเปปไทด์ ซึ่งประกอบด้วยกรดอะมิโนรวมอยู่กับสารประกอบที่มีมวลโมเลกุล 94 และ 136 ดาลตัล การศึกษาด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบส่งกราด พบว่า สารทำลายเชื้อแบคทีเรียที่แยกได้จากส่วนของซีรั่มและพลาสมาของจระเข้ ทำลายเชื้อแบคทีเรียโดยการเข้าไปในส่วนไซโตพลาสซึมของแบคทีเรียแล้วทำให้เมมเบรนของแบคทีเรียแตกหรือถูกทำลายในที่สุด และสำหรับในสารสกัดเม็ดเลือดขาวจระเข้ ในการศึกษานี้ได้แยกบริสุทธิ์เปปไทด์ด้วย HPLC จากนั้นศึกษาประสิทธิภาพการยับยั้งเชื้อจุลินทรีย์จำนวน 30 ชนิดและกลไกการเข้าทำลายเชื้อของเปปไทด์ที่แยกได้พร้อมกับศึกษาโครงสร้างของเปปไทด์โดยเทคนิค LC-MS-MS ผลการศึกษาพบว่า สารสกัดเม็ดเลือดขาวสามารถยับยั้งเชื้อแบคทีเรียได้ 8 ชนิด ได้แก่ Staphylococcus. epidermidis, Bacillus. megaterium, B. licheniformis TISTR 1010, Pseudomonas. aeruginosa, Ps. aeruginosa ATCC 27853, Salmonella. typhi, S. typhi ATCC 5784, Vibrio. cholerae และเชื้อรา 1 ชนิด ได้แก่ Candida. albicans จากนั้นแยกบริสุทธิ์สารสกัดเม็ดเลือดขาวด้วยคอลัมน์แลกเปลี่ยนประจุ พบโปรตีน 4 กลุ่มเป็นองค์ประกอบนั่นคือ P1, P2, P3 และ P4 โดยโปรตีน P1 และ P3 สามารถยับยั้งเชื้อ S. epidermidis, S. typhi และ C. albicans ได้ จากการศึกษาโดย Zymogram refolding gel และ Western immunoblotting พบว่าสารสกัดเม็ดเลือดขาวและ P1 มีโปรตีนขนาด 14 kDa ที่จับกันอย่างอ่อนๆกับ anti hen egg white lysozyme antibody จากนั้นทำการแยกส่วนของเปปไทด์ด้วยคอลัมน์ gel filtration และนำส่วนของเปปไทด์ มาแยกบริสุทธิ์ต่อด้วยคอลัมน์ C18 reverse phase HPLC ซึ่งพบเปปไทด์ที่เป็นองค์ประกอบหลัก 10 เส้นแต่มีเฉพาะ Leucrocin I, II, III และ IV ที่สามารถทำลายเชื้อแบคทีเรียที่นำมาทดสอบได้ โดย Leucrocin I, II, III และ IV มีคุณสมบัติในการฆ่า (Microbicidal activity) เซลล์แบคทีเรียได้แต่ก็มีความแตกต่างกันและมีความเป็นพิษต่อเซลล์เม็ดเลือดแดงของคน (HRBCs) แตกต่างกัน เมื่อศึกษาวิธีการทำลายเซลล์แบคทีเรียด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนพบว่าเปปไทด์ Leucrocin I และ II เข้าไปทำลายเซลล์แบคทีเรียในส่วนเมมเบรนชั้นใน ทำให้เซลล์แบคทีเรียแตกเสียหายและ/หรือตายในที่สุด นั่น แสดงว่าเป้าหมายของเปปไทด์อยู่ที่เซลล์เมมเบรนของแบคทีเรีย จึงทำการศึกษาวิธีการเข้าทำลายเซลล์เมมเบรนชั้นนอกของเชื้อ S. typhi (Leucrocin I และ II) และ V. cholera (Leucrocin III และ IV) โดยการวัดค่าการเรืองแสงที่เพิ่มขึ้นของสาร N-phenylnaphtylamine พบว่าเปปไทด์ ทั้งสองกลุ่มสามารถทำลายส่วนเมมเบรนชั้นนอกของเชื้อที่นำมาทดสอบได้โดยดูจากค่า fluorescence intensity ที่เพิ่มสูงขึ้น และได้ทำการวัดการแตกของเซลล์โดยการวัดความเข้มข้นของดีเอ็นเอที่ 260 nm พบว่าเชื้อ Staphylococcus epidermidis ถูกทำให้แตกด้วยเปปไทด์ทั้งหมดที่นำมาทดสอบ จากการศึกษาโครงสร้างปฐมภูมิโดยวิธี LC-MS-MS พบว่าลำดับกรดอะมิโนของ Leucrocin I คือ NGVQPKY และ Leucrocin II คือ NAGS_LSGWG จากการเปรียบเทียบลำดับกรดอะมิโนพบว่าเปปไทด์ทั้งสองชนิดไม่เหมือนกับเปปไทด์ใดๆในฐานข้อมูลจากการศึกษาทั้งส่วนโครงสร้างและกลไกการทำลายเชื้อแบคทีเรีย พบว่างานวิจัยนี้เป็นงานวิจัยแรกที่พบว่าในสารสกัดเม็ดเลือดขาวมี antimicrobial peptides ที่มีกลไกการทำลายเชื้อแบคทีเรีย โดยไปรบกวนการผ่านเข้าออกของสารบริเวณเมมเบรนของแบคทีเรีย แต่อย่างไรก็ตามยังต้องมีการศึกษากลไกการทำลายเชื้อแบคทีเรียเพิ่มเติมเพื่อให้เกิดประโยชน์สูงสุดในการนำไปใช้เป็นยา

บรรณานุกรม :
สมปอง ธรรมศิริรักษ์ . (2553). การศึกษาเปปไทด์ที่มีฤทธิ์ต้านเชื้อแบคทีเรียในเลือดจระเข้สายพันธุ์ไทย (Crocodylus siamensis).
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย.
สมปอง ธรรมศิริรักษ์ . 2553. "การศึกษาเปปไทด์ที่มีฤทธิ์ต้านเชื้อแบคทีเรียในเลือดจระเข้สายพันธุ์ไทย (Crocodylus siamensis)".
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย.
สมปอง ธรรมศิริรักษ์ . "การศึกษาเปปไทด์ที่มีฤทธิ์ต้านเชื้อแบคทีเรียในเลือดจระเข้สายพันธุ์ไทย (Crocodylus siamensis)."
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย, 2553. Print.
สมปอง ธรรมศิริรักษ์ . การศึกษาเปปไทด์ที่มีฤทธิ์ต้านเชื้อแบคทีเรียในเลือดจระเข้สายพันธุ์ไทย (Crocodylus siamensis). กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย; 2553.